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吉林省布鲁氏菌流行株种属鉴定及其耐药分子机制的研究

孙丽媛

  布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,是由布鲁氏菌属(Brucella)的细菌(简称布鲁氏菌)引起的一种人畜共患病,为《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类传染病之一,在世界各地都有广泛流行,严重威胁人类健康,尤其在发展中国家,是受到普遍关注的世界性公共卫生问题。全世界现有布鲁氏菌病患者约500~600万人,年新发病人数约有50万,全世界每年因布鲁氏菌病造成的经济损失可达30亿美元。由于该病临床症状缺乏特异性,容易慢性化,造成多器官多系统的损伤,严重时可致残,丧失劳动能力,因此早期诊断是控制布鲁氏菌病疫情的重要手段。目前诊断布鲁氏菌病主要依靠传统的病原学和血清学方法,但检测灵敏度低,特异性不高,培养时间长,无法做出快速、准确诊断而延误最佳治疗时机;此外传统的检测方法有潜在实验室暴露感染的危险,而且对检验人员技术要求较高,在一些实验室不作为常规检验项目;依靠分子生物学的布鲁氏菌病诊断方法由于其安全性好、灵敏度高、特异性强一直是实验室的研究热点,但因成本和技术的原因一直未真正应用于临床。因此建立敏感性强、特异性高、技术简单、成本低的诊断技术替代和补充现有的临床诊断方法势在必行。 本研究从疑似布鲁氏菌病患者的血液标本中分离布鲁氏菌,分析吉林省布鲁氏菌主要流行菌株;建立快速检测和鉴别布鲁氏菌的荧光定量PCR方法,该方法通过扩增布鲁氏菌属和羊、牛、猪布鲁氏菌的特异性基因片段,能快速、简便、灵敏的检测布鲁氏菌属并能快速鉴别羊、牛、猪布鲁氏菌。与培养方法和常规PCR方法相比,该方法灵敏度高,特异性强,有望成为一种新的布鲁氏菌快速检测手段;本研究还分析临床分离布鲁氏菌药敏试验结果并设计耐药诱导实验,诱导产生耐喹诺酮类药物的耐药菌株,探讨布鲁氏菌耐喹诺酮类药物的耐药机制。 1.吉林省布鲁氏菌流行株的分离培养与鉴定 由于布鲁氏菌病临床表现多样化,缺乏特异性,常需要实验室检查来确诊,分离培养是目前诊断布鲁氏菌病的“金标准”。本试验采集106份疑似布鲁氏菌病患者血液标本,采用双相血液培养瓶进行增菌培养,用L-B琼脂培养基、布氏培养基和肝浸液培养基进行纯培养,分离鉴定布鲁氏菌14株,培养阳性率为13.21%。布鲁氏菌初次分离培养时间比较长,需要5d~17d。经生化反应试验、染料抑制试验、单因子血清凝集试验、CO_2需求试验、H_2S生成试验鉴定,7株为羊布鲁氏菌3型,3株为羊布鲁氏菌1型,2株为牛布鲁氏菌3型,2株为猪布鲁氏菌1型。临床分离菌株以羊布鲁氏菌3型居多,这与吉林省历史上曾分离的流行株型别相吻合。 2.布鲁氏菌属荧光定量PCR快速鉴定的研究 本研究建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌属细菌,并对其进行评价。定量方法采用绝对定量,即根据测定的Ct值,用标准曲线对靶基因的起始拷贝数进行定量。以IS711基因设计引物,采用矩阵式对引物和模板的浓度进行优化,最终确定最佳引物量为0.4μl,DNA模板量为2.0μl。制备的标准曲线斜率(k)为-3.615,相关系数(r)为-0.99,扩增效率(E)为90%。该方法对布鲁氏菌属细菌均可阳性扩增,而对其他菌株及所设置的阴性对照扩增结果阴性,目的片段熔解曲线仅有单一尖峰,反应中没有引物二聚体形成和非特异性扩增产物产生。Ct值变异系数均小于5%,表明该检测体系稳定,具有良好的重复性。 本研究利用活菌计数评价荧光定量PCR方法的敏感性。检测靶基因拷贝数为3.826×10~1copies/μl,相当于5CFU/ml~10CFU/ml时Ct值为33.21。在模拟血液标本中检测靶基因拷贝数为3.523×10~1copies /μl时Ct值为35.87。106份临床血液标本有36份呈阳性扩增,阳性率为33.96%,明显高于培养方法。 应用引物IS711所建立的荧光定量PCR方法,能快速地鉴定布鲁氏菌属细菌,整个反应仅需25min。该方法具有高度的特异性和敏感性,重复性好,对模拟标本和临床标本均得到预期的结果,今后应完善血液标本提取细菌DNA的方法,使其能更有效的应用于临床。 3.布鲁氏菌种荧光定量PCR快速鉴定的研究 羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌是我国布鲁氏菌病公共卫生最常见的流行菌株。用ARTEMIS软件分析三种吉林省常见布鲁氏菌的差异基因并设计引物,建立3个独立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,能安全、快速、敏感地鉴定常见的羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌和猪布鲁氏菌。采用绝对定量方法,制备的羊、牛、猪布鲁氏菌荧光定量的标准曲线斜率分别为-3.241、-3.447及-4.608。羊、牛荧光定量PCR扩增效率达到102%和94%,猪荧光定量PCR的扩增效率偏低为66%。羊、牛、猪布鲁氏菌荧光定量PCR标准曲线R~2=1,表明模板靶基因起始拷贝数的对数与Ct值呈现很好的线性关系。 该方法特异性强,对相应的布鲁氏菌种扩增结果为阳性,而对其他菌株及所设置的阴性对照扩增结果为阴性,目的片段熔解曲线均仅有单一峰,反应中没有引物二聚体形成和非特异性扩增产物产生。Ct值变异系数均在5%以下,表明检测体系稳定,具有良好的重复性。 该方法敏感性强,建立的羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌荧光定量PCR检测灵敏度均为10CFU/ml~30CFU/ml,最低检测靶基因的拷贝数为10~1copies/μl;猪布鲁氏菌荧光定量PCR检测灵敏度为10~2CFU/ml,最低检测靶基因的拷贝数为10~2copies/μl。在模拟血液标本中羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌荧光定量PCR检测的灵敏度为10~1copies/μl,猪布鲁氏菌鉴定的灵敏度是10~2copies/μl。布鲁氏菌属荧光定量PCR扩增阳性的36份临床血液标本,应用布鲁氏菌种荧光定量PCR方法鉴定,结果28份鉴定为羊布鲁氏菌,6份鉴定为牛布鲁氏菌,2份鉴定为猪布鲁氏菌。说明在布鲁氏菌感染中以羊布鲁氏菌感染居多,与分离培养的结果相符。 综上所述,所建立的布鲁氏菌种荧光定量PCR方法能快速鉴定羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌和猪布鲁氏菌,特异性很高。羊种和牛种的鉴定体系完善,扩增效率高,检测的灵敏度高,猪种的鉴定体系由于扩增效率偏低,造成检测的灵敏度偏低,但不影响实验的特异性,今后应进一步优化猪种鉴定体系,提高其扩增效率,从而提高其检测灵敏度。 4.布鲁氏菌对喹诺酮类药物耐药机制的研究 本实验对临床分离的喹诺酮类药物敏感的布鲁氏菌菌株进行体外诱导耐药,测定其诱导前后MIC,诱导前敏感菌株MIC仅为0.25μg/ml~0.5μg/ml,表明喹诺酮类药物治疗布鲁氏菌感染有很好的潜力。经过左氧氟沙星多次诱导后产生2株稳定的耐药菌株, MIC分别为64μg/ml及128μg/ml,增加了128倍和256倍,而且2株耐药菌株对其它喹诺酮类药物均产生了交叉耐药,揭示了喹诺酮类药物治疗布鲁氏菌感染的局限性。 本实验对gyrA基因进行PCR扩增和序列分析,结果显示耐药菌株均在gyrA基因喹诺酮耐药性决定区(Quinolone resistance-determing region,QRDR)发生了典型的基因突变,对扩增的gyrA基因进行氨基酸序列推导,GyrA的氨基酸改变区域是第87位的丙氨酸(密码子GCU)置换为缬氨酸(密码子GUU),第91位的天冬氨酸(密码子GAU)置换为甘氨酸(密码子GGG)和缬氨酸(密码子GUG)。实验结果表明gyrA基因突变是布鲁氏菌对喹诺酮类药物耐药的主要机制。 综上研究结果表明吉林省布鲁氏菌病主要的病原是羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌和猪布鲁氏菌,以羊布鲁氏菌居多;建立了布鲁氏菌属荧光定量PCR方法,可以对布鲁氏菌属的细菌进行定量检测,具有极高的敏感性、特异性和稳定性;建立了布鲁氏菌种的荧光定量PCR方法,可对羊、牛、猪布鲁氏菌进行快速鉴别和定量,与传统方法比较具有安全、敏感、快速、特异等优点;实验诱导产生的2株耐药菌株,对喹诺酮类药物均产生交叉耐药,主要耐药机制是gyrA基因的QRDR发生突变。……   
[关键词]:布鲁氏菌;荧光定量PCR;检测;诱导耐药;gyrA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2011年