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拟南芥F-box基因AtPP2-B11的功能分析及苹果RING finger型泛素连接酶E3的家族分析

李彦泽

  泛素/26S蛋白酶体途径是一类重要的翻译后修饰过程,它能有效地调节功能蛋白质的选择性降解,是生命过程进行精确时空调控的重要环节之一。其中,泛素连接酶E3是在底物的特异性选择降解过程中作用最为关键成员。拟南芥基因组中大约5%的基因(大约1400多个基因)编码泛素连接酶。在众多的泛素连接酶类型中,F-box型和RING finger型是家族成员最多的两大类。本文通过对F-box和RING finger型基因的功能和结构的分析,揭示了泛素连接酶E3在基因表达调控中的重要作用。结果如下: (1)本文首先分析了一个拟南芥F-box类型蛋白的功能。利用生物信息学的方法,在拟南芥1488个泛素连接酶E3中分离到了31个含有DRE元件的E3,通过RT-PCR的方法确定了它们在干旱处理下的表达量变化情况,并从中挑出了一个受干旱诱导较明显的F-box基因AtPP2-B11进行了进一步的研究。 (2)qRT-PCR的实验证明,AtPP2-B11受到干旱的诱导。GUS活性实验表明,AtPP2-B11基因上游启动子区域的DRE元件对于干旱响应起到了一定作用。同时,实验证明AtPP2-B11基因还受到ABA的部分诱导,表明AtPP2-B11基因可能是通过依赖ABA和不依赖ABA两种途径参与对干旱的响应。 (3)将AtPP2-B11基因转入野生型拟南芥中进行干旱处理实验,发现超表达AtPP2-B11基因明显的减弱了植株的干旱抗性。qRT-PCR检测LEA14,COR15a,RD29A等下游干旱响应基因时发现,在干旱处理时下游基因的RNA水平均降低,干旱处理后下游基因发生了不同程度的下调,表明AtPP2-B11基因可能通过影响这些下游基因从而改变了植株的抗旱性。 (4)通过酵母双杂交系统,我们以AtPP2-B11蛋白为诱饵,筛选了拟南芥干旱诱导的cDNA文库,共得到约20个阳性克隆,测序后发现可以与AtPP2-B11蛋白发生相互作用的蛋白包括LEA14,HSP70等蛋白。利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步分析发现,AtPP2-B11蛋白可以与LEA14蛋白发生相互作用,暗示了AtPP2-B11基因很可能作为一个负调因子,通过调节LEA14基因的活性来影响植株的干旱抗性。 (5)另外,我们还利用生物信息学的方法对苹果中的RING finger型蛋白进行了数量和结构的预测及鉴定。我们发现在苹果的基因组中有688个RING finger结构域分布于634个RING型蛋白中。根据其结构特征我们将苹果中的688个RING finger结构域分为9大类:367个RING-H2,208个RING-HC,10个RING-C2,35个RING-v,1个RING-D,11个RING-S/T,2个RING-G,10个RING-mH2和44个RING-mHC。其中,前7类是在拟南芥中曾经出现过的,后2类是在苹果中首次发现的。结构分析描述了每一种RING型结构域的典型特征。同时还鉴定了RING型蛋白中除了RING结构域以外的其他结构域,为将来RING finger蛋白的功能研究奠定基础。……   
[关键词]:F-box;DRE元件;AtPP2-B11;干旱;生物信息学;RING finger;苹果
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年