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番茄转录因子SlMYB12介导的类黄酮合成过程中的功能研究以及水稻抗病相关基因OsDRxoc5的功能分析

于丹丹

  本研究包括两部分相对独立的内容。 类黄酮是一类天然的植物次生代谢产物,具有抗氧化和抗病毒病等重要功能,目前广泛种植的番茄仅含有少量的类黄酮。本研究通过利用番茄果实特异性表达启动子E8,转化番茄内源类黄酮调控基因SlMYB12,获得一系列富含类黄酮(芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮)和咖啡酰奎尼酸的番茄转基因株系,验证了番茄内源SlMYB12基因能如拟南芥AtMYB12一样具有调节类黄酮合成的功能。 研究中采用pX6-GFP载体、高保真PCR技术,通过分步克隆策略,构建了植物表达载体pX6-E8::SlMYB12,并导入农杆菌工程菌株AGL1。通过叶盘法转化番茄品种Micro-Tom、CSl09-03、圣女果,分别获得PCR阳性转基因植株15株、20株和31株。 利用HPLC对转基因株系进行了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测,三个转基因材料都有明显的提高。其中,Micro-Tom背景下株系CD07T-2和CD07T-7果皮芦丁含量达到15.66和12.99 mg﹒g~(-1) DW,与对照相比提高了12~(-1)4倍;咖啡酰奎尼酸主要存在于果肉,提高也很明显。CSl09-03背景下,株系CD08T-8果皮芦丁达到7.94 mg﹒g~(-1) DW,提高了36.8倍;株系CD08T~(-1)3咖啡酰奎尼酸提高了18.7倍;山奈酚芸香苷平均提高了2-3倍。圣女果背景下,株系CD09-7、CD09~(-1)5、CD09-20、CD09-33果皮芦丁提高了24.4-33.6倍,CD09-30和CD09-7果皮山奈酚芸香苷分别达到1.16和7.20 mg﹒g~(-1) DW;CD09-20和CD09-33果实咖啡酰奎尼酸达到1.50和2.25 mg﹒g~(-1) DW,总体类黄酮和咖啡酰奎尼酸提高显著。 该研究结果为后续以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮生物制品,得到具有食用安全性的番茄新品种,进行品种培育和产业化加工奠定基础。 另一方面,水稻细菌性条斑病平均每年造成水稻减产10%-20%,目前还没有有效的防治方法。本研究利用高保真PCR技术,对一个病原诱导表达基因OsDRxoc5(编码热激蛋白)进行分离克隆,转化粳稻材料牡丹江8号和圣稻806并进行基因功能验证,探索基因OsDRxoc5在细条病互作中的功能。 研究利用超量表达和双链RNAi抑制技术,构建了超量表达载体pU1301-OsDRxoc5和抑制表达载体ds1301-OsDRxoc5,导入农杆菌工程菌株EHA105。采用农杆菌转化法将上述两个载体转化牡丹江8号和圣稻806,分别获得PCR阳性转基因植株49/45株、44/30株。 选择细菌性条斑病菌株RS105,采用活体穿刺接种的方法对上述转基因株系进行抗病性检测。结果显示基因OsDRxoc5超量表达植株明显比非转基因对照抗病,RNAi转基因植株也相比对照组呈现一定程度的感病,表明OsDRxoc5可能是一个正调控因子,参与水稻细条病抗性并有望用于抗细条病育种,从而为抗细菌性条斑病水稻育种储备了基因资源。……   
[关键词]:类黄酮;HPLC;生物反应器;水稻细条病;OsDRxoc5;超量表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年