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生姜蛋白酶的双水相萃取纯化技术研究

谢芳

  本研究以生姜为原料,于2009-2011年在山东农业大学食品科学与工程学院功能食品研究室进行,主要研究了运用双水相萃取技术(ATPE)分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件,分析了双水相成相因素对生姜蛋白酶萃取的影响,利用该技术得到了生姜蛋白酶的等电点及三步双水相萃取纯化生姜蛋白酶的流程。主要结果如下: 1.单盐双水相体系的建立 最佳PEG分子量为4000,PEG浓度为30%,选择盐种类为硫酸铵,浓度为10%,体系pH为8.0,操作温度选择室温,样品加入量为3 mL。此双水相体系的生姜蛋白酶上相酶活力回收和纯化倍数都最高,分别可达87.24%和1.85。 2.缓冲盐双水相体系的建立 最佳PEG分子量为4000,PEG浓度为20%,缓冲盐pH为6.5,缓冲盐浓度为10%,此双水相体系的上相酶活回收和纯化倍数都最高,分别达94.99%和1.86。 3. PEG/(NH_4)_2SO_4双水相体系及PEG/(NaH_2PO_4-Na_2HPO_4)双水相体系的各相平衡关系的线性方程 各分子量PEG/(NH_4)_2SO_4相平衡关系的线性方程分别为:y=613.33e~(~(-0.2139x)) ;y=260.66e-~(0.2036x)) ;y=178.46e~(~(-0.1969x)) ;y=79.91e~(-0.174x) ;y=124.52e~(-0.2492x) ; y=282.31e-0.4302x)。各分子量PEG /(NaH_2PO_4-Na_2HPO_4)相平衡关系的线性方程分别为:y=327.41e-0.2706x) ; y=170.9e~(-0.247x) ; y=105.9e~(-0.2508x) ; y=91.385e~(-0.3029x) ; y=106.04e~(-0.4173x) ; y=73.272e~(-0.3836x)。 4.交错分配法(cross partitioning)测定生姜蛋白酶的等电点(pI) 通过交错分配法测定生姜蛋白酶的等电点,得出生姜蛋白酶的等电点有两个:即4.1和6.4,说明生姜蛋白酶含有两个组分而且属于酸性蛋白酶。 5.三步双水相萃取提取和纯化生姜蛋白酶流程的建立 建立了三步双水相萃取提取和纯化生姜蛋白酶的流程,其中第二步萃取加入的盐浓度为20%,量为10 mL,第三步萃取加入的盐浓度为12%,量为15 mL。 6.双水相纯化蛋白效果检测 生姜蛋白酶粗酶液通过分子筛层析Sephadex G-50后,得到两个蛋白峰,双水相萃取酶液仅得到一个蛋白峰,对所得蛋白峰测定其酶活,结果与粗酶液所得酶活相比酶活损失不大。……   
[关键词]:双水相萃取;生姜蛋白酶;交错分配法;三步萃取
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年