手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

黑麦草抗冻蛋白基因的克隆、原核表达及植物转基因研究

邓顺阳

  抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能在低温结冰条件下保护生物体不受伤害。抗冻蛋白具有两种明显不同的抗冻活性--热滞(thermal hysteresis,TH)活性和重结晶抑制(recrystallizationinhibition,RI)活性。鱼类和昆虫抗冻蛋白的特征是高TH低RI活性,而植物抗冻蛋白的特征是低TH高RI活性。与鱼类和昆虫抗冻蛋白相比,植物抗冻蛋白更适合于植物转基因、食品冷冻保藏和细胞、组织、器官等的低温保存。耐寒性极强的常绿草本植物多年生黑麦草(Lolium perenne)内含活性较强的耐热的抗冻蛋白。本论文对黑麦草抗冻蛋白(LpAFP)的基因克隆、原核表达与纯化、结构分析与定点突变、植物过量表达载体构建进行了研究,结果如下: (1)黑麦草抗冻蛋白的基因克隆:对黑麦草进行冷胁迫处理后,提取叶片总RNA,采用RT-PCR法获得了黑麦草抗冻蛋白的cDNA克隆。序列分析结果表明,该cDNA的开放读码框(ORF)长度为357bp,编码一条由118个氨基酸组成的多肽。生物信息学分析结果表明,黑麦草成熟抗冻蛋白与禾本科的植物抗冻蛋白同源,有保守冰晶结合域,与鱼类和昆虫抗冻蛋白则没有同源性。 (2)黑麦草抗冻蛋白的原核表达与纯化:把LpAFP的cDNA分别连接到pET32a和pET28a中,构建融合和非融合2种原核表达质粒,并在BL21(DE3)大肠杆菌中实现高效表达。获得优化培养诱导条件:在M9培养基中,诱导菌液起始光密度(OD600)为1.25,IPTG的终浓度为0.2μM,融合表达载体高效表达的诱导时间为6-8h;非融合也在此条件下实现高效表达。诱导表达的非融合表达蛋白通过100℃热处理、Ni-NTA亲和层析、反向HPLC三步分离纯化,获得大量高纯度有活性的LpAFP,可用于NMR测定LpAFP的高级结构。 (3)黑麦草抗冻蛋白的结构分析与定点突变:LpAFP理论三维结构为一个大的右手β-螺旋结构,每一圈螺旋由2个β-折叠组成了一个相对平行的冰晶结合表面,每个折叠都有重复 XXNXVXG 基序,这个重复基序中关键氨基酸的改变将影响冰晶结合表面,可用于改进LpAFP的抗冻活性。采用交错PCR对LpAFP的cDNA序列进行定点突变,使其序列特征更加符合 XXNXVXG 重复基序特征,分别构建系列点突变的原核非融合表达质粒,诱导其高效表达。 (4)黑麦草抗冻蛋白的植物过量表达质粒构建:采用交错PCR方法,分别将上游启动元件、增强子、LpAFP的cDNA、下游终止子等顺式作用元件进行体外连接、组装,并插入到植物表达载体pCAMBIO2301中,构建了LpAFP的植物过量表达载体,通过农杆菌介导法成功转入烟草,分子检测表明,LpAFP的cDNA整合到烟草基因组中并获得稳定遗传。……   
[关键词]:抗冻蛋白;抗冻活性;热滞活性;重结晶抑制活性;冰晶结合位点;表达与纯化;定点突变;植物转基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中南林业科技大学2010年