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桉树4个种遗传多样性的ISSR分析及STS标记开发初探

田华

  桉树是世界上第二大类人工造林树种,亦是目前最重要的木浆原料林之一。桉树种类繁多,有522种和150个变种,桉树树种之间容易杂交培育出超过亲本的杂交种,并容易培育成优良无性系进行无性繁殖,但其种源关系和品种鉴定较为困难。ISSR现已在林木的种质资源鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育、分子标记育种等研究方面被广泛应用。ISSR标记以其多态性高、稳定性强、技术简便、方便快捷等优势必将使其在更多林木物种、更多林业领域获得应用。 本论文以桉树的赤桉、巨桉、细叶桉和粗皮桉4个种18个样品为研究材料,分析了影响桉树ISSR-PCR的主要参数,包括模板DNA、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度等6个因素的影响,建立了适用的ISSR-PCR的分析体系:20μL的PCR反应体系中,1 x Taq酶缓冲液,0.5 U Taq DNA聚合酶,0.6μmol/L引物,100μmol/L dNTPs,2.5mmol/LMgCl2,20ng模板DNA;最佳PCR扩增条件为:预变性:94℃3min;94℃变性30sec,60℃退火45sec,72℃延伸1min 5个循环;58℃退火45sec,72℃延伸1min 5个循环;56℃退火45sec,72℃延伸1 min 5个循环;54℃退火45sec,72℃延伸1min 10个循环;52°退火45sec,72℃延伸1min 20个循环;共40个循环后,最后72℃延伸10min,4℃保存。 根据优化的ISSR-PCR反应体系和扩增条件,从100条引物中筛选出12条扩增条带特异、条带数适中、背景清晰、重复性好的引物,总计扩增出120条清晰可重复的DNA条带,其中93条是多态性条带。每个引物可扩增的多态条带长度范围为300~2500 bp,数目在4~11条,平均为7.75条,多态带百分率为77.5%。然后通过软件POPGENE1.31、MVSP 32软件和NTSYS-pc软件对所得数据进行总结分析,从而得出4个种18个样品的遗传相似系数,并绘制分子聚类图和主坐标分析图,结果表明,4个种间遗传相似性差异较大,种内遗传相似性极高。 此外,还对ISSR特异扩增序列进行回收测序,根据测序结果设计出19对桉树的STS标记的正反引物,筛选出6对引物可以扩增出目的条带,从而为开发出桉树的适宜STS分子标记打下了基础。……   
[关键词]:桉树;遗传多样性;分子标记;ISSR;STS;分子鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中南林业科技大学2009年