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血管紧张素Ⅱ在脑缺血再灌注损伤后凝血酶神经毒性机制中的作用及药物干预研究

孙霞

  目的:脑血管疾病严重危害人类健康,其中缺血性脑血管疾病最常见。尽管对缺血性脑血管病的发病机制做了大量研究,但目前治疗该病的有效药物较少,急待在理论研究的基础上寻找防治缺血性脑血管病的有效药物。凝血酶在脑缺血再灌注损伤中(CIR)发挥神经毒性作用。但是,脑缺血再灌注损伤中调控凝血酶表达的分子机制至今尚未见报道。肾素-血管紧张素系统(RAS)在脑血管疾病发生发展中的作用,近年愈来愈引起重视。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对脑血管疾病的发生和发展过程起着相当重要的作用,AngⅡ通过激活NADPH氧化酶(NOX)触发的氧化应激是导致CIR损伤的重要机制,对脑血管疾病的发生和发展发挥重要作用,但是AngⅡ-NADPH氧化酶是否参与凝血酶的调控及机制尚不清楚。 本课题分别从体内、体外探讨AngⅡ、NOX2等关键分子在凝血酶表达升高中的相互作用及机制,并观察了作用于RAS不同环节的药物即氯沙坦、羟基红花黄色素A对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中凝血酶神经毒性的作用,初步探讨两药防治缺血性脑血管病的作用机制。 方法: 1.体内实验:健康雄性Wistar大鼠,随机分为8组,即假手术组(sham, NS 5ml/kg·d)、缺血再灌注组(I/R, NS 5ml/kg·d)、氯沙坦高剂量(10mg/kg-d)、低剂量组(2.5mg/kg·d)、NOX抑制剂apocynin (2.5mg/kg)、羟基红花黄色素A高剂量组(8mg/kg)、中剂量组(4mg/kg)、低剂量组(2mg/kg)。采用改进的Zea Longa s大脑中动脉内栓线阻断法(MCAO)制备I/R模型,局部脑缺血2h再灌注24h,以Longa s神经功能学评分法检测神经损伤程度;HE染色用于检测海马锥体存活细胞计数及中性粒细胞浸润情况;ELISA方法测定血浆中凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)及凝血酶原片段1+2(F1+2)表达情况;Western blot及RT-PCR检测脑组织中NOX2、ICAM-1、TNF-α、凝血酶原mRNA及蛋白表达情况;Western blot检测NF-KB p65亚基核转位情况及IкBα蛋白表达情况;凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测NF-кB DNA结合活性;放免法检测脑组织及血浆中AngⅡ含量;测定脑组织中·02-及-OH的含量。 2.体外实验: 首先观察凝血酶对培养的星形胶质细胞的神经毒性作用。分为5组:①正常对照组;②凝血酶组5U/ml组;③凝血酶+10-6mol/L氯沙坦组(losartan, Los);④凝血酶5U/ml+10-6mol/LPD123319组(PD);⑤凝血酶5U/ml+10-6mol/L氯沙坦+10-6mol/L PD123319组(凝血酶+Los+PD)。MTT法检测星形胶质细胞存活率,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率及检测NF-кB p65 mRNA及蛋白表达水平。 然后探讨AngⅡ参与凝血酶调节的分子机制。①10-6mol/L AngⅡ孵育24h刺激处理培养的星形胶质细胞检测Rac1、NOX2、凝血酶原、PAR1、ICAM-1、TNF-α的表达,方法同上;同时检测SOD的活性;②10-6mol/L AngⅡ孵育刺激处理细胞前,I NOX抑制剂apocynin;Ⅱ检测上述指标的表达;Ⅲ观察10-6mol/L选择性AT1受体拮抗剂氯沙坦、10-6mol/L选择性AT2受体拮抗剂PD123319对上述指标的影响。 结果:1.与假手术组相比,大鼠脑缺血2h再灌注24h后,神经功能严重损伤,即表现为神经功能学评分显著升高;HE染色显示缺血侧的脑组织海马CA1区表现为明显的缺血及坏死,且有大量的中性粒细胞浸润;血浆中凝血酶相关活性产物即凝血酶原-抗凝血酶原复合物(TAT),凝血酶原片段1+2(F1+2)含量明显升高;NOX2、ICAM-1、TNF-α、凝血酶原mRNA及蛋白在大鼠CIR模型中海马区表达亦明显升高;NF-κB p65亚基发生核转移,NF-KB被激活,DNA结合活性亦明显升高;IкBα蛋白表达水平明显降低;血浆及脑组织中AngⅡ含量显著升高。给予氯沙坦、apocynin及羟基红花黄色素A可在不同程度上逆转或减轻I/R损伤的相应变化。2.5U/ml凝血酶组可明显降低星形胶质细胞的存活率,使细胞上清液中的LDH漏出率增加及促进NF-κB的表达;10-6mol/L氯沙坦可明显抑制凝血酶诱导的神经细胞损伤,而单独应用10-6mol/LPD123319对此无明显影响。3.10-6mol/L AngⅡ处理体外培养的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞后,SOD活性降低;NOX2、凝血酶原、PAR1、I CAM-1、TNF-α表达亦明显升高。应用NOX抑制剂apocynin后,AngⅡ诱导的上述反应明显抑制。10-6mol/L氯沙坦可明显抑制AngⅡ诱导的上述反应,而单独应用10-6mol/LPD123319对此无明显影响。 结论: 1.凝血酶在脑缺血再灌注损伤中(CIR)发挥神经毒性作用。 2. AngⅡ参与调控凝血酶表达的分子机制(至少部分)是通过AngⅡ-AT1R-NOX2-ROS信号通路而实现的。 3.AT1受体拮抗剂氯沙坦可抑制缺血脑组织及AngⅡ孵育的星形胶质细胞中NOX2、凝血酶原、PAR1、ICAM-1、TNF-α的表达,其对脑缺血保护的作用是(至少部分)通过阻断AT1受体,抑制AngⅡ参与的NADPH氧化酶(NOX2)信号通路,从而抑制凝血酶表达而实现的。 4.羟基红花黄色素A可通过降低AngⅡ的含量抑制脑缺血后凝血酶的产生及抑制继发的炎症反应,而对脑缺血再灌注损伤发挥其脑保护作用。 意义:缺血性脑血管疾病已经成为严重危害我国老年人健康的常见疾病,并有逐年上升的趋势,但由于其发病机制尚不十分清楚,对其防治带来困难。近年发现,凝血酶在脑缺血中发挥重要作用。但是,调控凝血酶表达的分子机制一直是一个悬而未决的问题。AngⅡ通过激活NADPH氧化酶触发的氧化应激是导致脑缺血-再灌注损伤(CIR)的重要机制,我们推测AngⅡ-NADPH氧化酶可能在凝血酶参与的CIR中发挥重要调节作用。我们前期研究表明,氯沙坦、羟基红花黄色素A两药具有防治缺血性脑血管病的作用。但其机制是否与抗凝血酶毒性有关未见报道。 本研究将对AngⅡ-NADPH氧化酶调控凝血酶的分子机制及此通路在CIR中的作用进行深入研究,完善AngⅡ的致病机制,并从AngⅡ-NADPH氧化酶-凝血酶信号通路这一角度为缺血性脑血管病的防治提供一个全新的思路,为药物开发提供新靶点,具有重要的理论意义和应用价值。我们对近5年的文献进行了初步查阅和检索,国内未见与本课题相同或类似的研究。 创新点: 1.本研究首次揭示了AngⅡ在凝血酶诱导的神经毒性的重要作用,研究NOX2在其中的作用和调控,为进一步研究凝血酶的神经毒性机制提供了理论基础。 2.氯沙坦、羟基红花黄色素A均能有效的阻止凝血酶的表达,从而减少凝血酶过表达所引起的细胞毒性,为其发展成治疗凝血酶介导的脑血管疾病的新型药物奠定了理论基础。 3.我们首次提出干预AngⅡ-NOX2-凝血酶信号通路对脑缺血进行治疗,以期找到防治缺血性疾病的新策略。……   
[关键词]:血管紧张素Ⅱ;AT_1受体;凝血酶;NADPH氧化酶;氯沙坦;脑缺血再灌注
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东大学2010年