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大肠杆菌色氨酸高产菌株的构建

左祖桢

  色氨酸(tryptophan, Trp)是一种重要的营养必需氨基酸,只能由微生物或植物合成。L-色氨酸是8种必须氨基酸之一,人和动物只能从食物中摄取。本实验采用诱变育种及基因克隆手段对一株大肠杆菌进行改造,以望获得能进行大规模工业化生产的L-色氨酸高产菌株。 以大肠杆菌(Escherichia coli)MD-T109为出发菌株,经NTG诱变处理,筛选得到7株酪氨酸营养缺陷型突变株。经摇瓶发酵产酸检测,其中1株产酸比出发菌株降低,4株产酸与出发株相当,只有两株L-色氨酸产量较出发菌株得到提高,其中MD-T109-06突变株产酸量较出发菌提高了11.23%,生长速率未受到影响,且遗传稳定性良好。 进一步对MD-T109-06突变株进行改造。PCR扩增其trpEDCBA基因并克隆到含tac启动子的pMD-T109表达载体中,电转导入宿主得到工程菌MD-trp-06。经摇瓶发酵产酸检测,其L-色氨酸产量从0.206g/dL提高到0.238g/dL,提高15.5%。工程菌邻氨基苯甲酸合成酶活性提高140%,色氨酸合成酶活性提高166%。 为解决高密度发酵过程中通常存在的溶氧限制问题,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)引入工程菌MD-trp-06中。根据Genbank公布的vgb基因及其低氧诱导启动子的序列信息,并按照大肠杆菌偏好密码子进行修饰,人工合成修饰后的vgb片段,通过酶切连接将其克隆到表达质粒pMD-trp,电转化导入MD-trp-06,获得工程菌MD-trp。经低氧诱导vgb基因的表达,摇瓶发酵验证,在250 ml三角瓶中60ml及100ml装液量条件下,检测到vgb基因的表达工程菌相比出发菌株菌浓分别提高了21%和16%,色氨酸产量则提高了16.4%和21%。SDS-PAGE检测到VHb蛋白条带的表达。……   
[关键词]:L-色氨酸;NTG诱变;TrpEDCBA基因;透明颤菌血红蛋白;低氧诱导表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建师范大学2010年