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L-缬氨酸产生菌的选育及其发酵条件的调控

袁丹丹

  要提高发酵工业中L-缬氨酸的产量和质量,必须对生产菌种的选育及其工艺条件的优化两方面进行深入研究。目前代谢控制育种已成为了菌种改良的主要策略。本研究探索了L-缬氨酸产生菌NJ-5的选育、最佳发酵条件的确定以及三株菌的代谢流分析比较等,主要的研究内容及结果如下: (1)以黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum)NV128和JV16 (Leu-Ile-Met-)为亲本菌株,通过单灭活原生质体融合,在高糖梯度平板上筛选出一株抗高糖融合子NJ-2,经摇瓶发酵72h,产酸可达42.3g/L。并研究了影响原生质体融合的几个重要条件(青霉素、蛋清溶菌酶和渗透压稳定剂),确定了最佳处理浓度和时间。 (2)对原生质体融合获得的菌株NJ-2进行高糖梯度传代适应性培养及同步富集培养,并经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理,以高浓度α-氨基丁酸(α-AB)和2-噻唑丙氨酸(2-TA)平板定向筛选,获得一株L-缬氨酸产生菌NJ-5(Glchrα-ABr 2-TAr),该菌在未优化条件下发酵72h,产酸达到47.2g/L。 (3)利用正交设计试验对菌株NJ-5的种子培养基进行了优化,确定了种子培养基的最佳组成(g/L):葡萄糖25, KH2PO4 1, (NH4)2SO4 3, MgSO4·7H2O 0.5,玉米浆40, CaCO310;最佳装液量为25mL/250mL,最佳初始pH为7.0。 (4)对影响菌株NJ-5的发酵培养基组成和发酵条件进行了研究。在单因素的实验基础上,用Design Expert软件建立响应曲面模型,优化了影响发酵培养基组成的三个重要因素,确定了摇瓶发酵培养基最佳组成(g/L):葡萄糖135, (NH4)2SO4 45, KH2PO4 1.2, MgSO4·7H2O 0.6,玉米浆10.1, VH 75μg/L, VB1 90μg/L, CaCO3 30;最佳培养条件为:pH7.0~7.5,接种量为5%。同时在该优化的条件下,发酵72 h,摇瓶产酸达52.3g/L;7L发酵罐产酸达53.8g/L。 (5)建立并完善了出发菌株及菌株NJ-5合成L-缬氨酸的代谢网络模型,并对三株菌主要节点处的流量分配进行了分析。结果表明,选育株与出发菌株相比流入丙酮酸节点处的流量增加,流向TCA循环的流量减少,流入TCA回补反应的流量减少,流量朝着利于L-缬氨酸合成的方向流动。总结发现,几种选育手段的结合可以更有效地将代谢流导向L-缬氨酸的合成,从而为下一步的育种设计提供参考。……   
[关键词]:L-缬氨酸;育种;发酵条件优化;代谢流分析;调控
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2010年