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氯霉素兔单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

陆蕾

  氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一种广谱抗生素,对革兰氏阳性菌、阴性菌均有良好的抑制作用。因而广泛应用于畜牧、水产养殖业。但在动物性食品内残留的CAP对人体的健康具有潜在的危害。为此,世界上许多国家均制定了氯霉素的最高残留标准,严格限制其使用。为了适应加入WTO后的国际竞争与挑战,必须建立起一种具有自主知识产权的快速检测方法。酶联免疫吸附检测法(ELISA)作为一种快速、高效的免疫检测技术正逐步应用于CAP的检测。本研究用重氮化法合成了氯霉素的人工抗原,通过免疫兔子获得脾脏,继而利用杂交瘤技术、重组抗体技术获得高亲和性、高特异性的抗氯霉素的单克隆抗体,优化了间接竞争ELISA法的检测条件,初步建立了牛奶、蜂蜜等样品中氯霉素残留的ELISA检测技术。主要研究结果如下: 1氯霉素人工抗原的合成及鉴定 用重氮化法合成了氯霉素免疫抗原(CAP-BSA)以及包被抗原(CAP-OVA).用紫外扫描、SDS-PAGE电泳、飞行时间质谱对免疫抗原进行鉴定,证实人工抗原合成成功。用飞行时间质谱测定免疫抗原中BSA与CAP的偶联率为1:22。利用BCA蛋白试剂盒测得免疫抗原蛋白浓度为3.8mg/mL,包被抗原蛋白浓度为2.0mg/mL。 2免疫及兔抗血清筛选 用CAP-BSA免疫4只新西兰大白兔,编号76,77,78,79。以HRP为二抗,TMB为显色体系,对四只兔子的抗血清进行ELISA检测。其中76号兔子抗血清效价达128000,IC50达0.16μg/mL,选择76号兔子脾脏进入下一步融合。 3兔单克隆抗体的制备及纯化 采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强,细胞生长状态良好的杂交瘤细胞9-3。小转后获得了6株CAP单抗质粒。通过间接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定CAP 9-3H1/L2质粒进入大转生产。采用Protein A纯化方法纯化并收集CAP单克隆抗体,共得10mLCAP单克隆抗体,IgG浓度为1.23mg/mL。 4 ELISA检测条件优化 通过间接ELISA试验以及间接竞争ELISA试验,对CAP单抗ELISA检测条件进行了优化,最终确定CAP单抗ELISA检测条件如下:包被原10000倍稀释,50 uL每孔,4℃包被12h;含0.05%Tween-20的TBST洗涤四次;3%脱脂乳封闭1 h;用pH 8.0,离子浓度为0.1mol/L的TBS缓冲液稀释小分子竞争物和一抗。一抗稀释16000倍,与系列浓度的小分子竞争物各50uL,37℃孵育1h;12000倍二抗,50uL/每孔,37℃反应45min;显色底物配方:A液B液等体积混合。50uL/每孔,显色15 min;2mol/L硫酸,50 uL/每孔终止,OD450读数。 5抗体免疫学性质研究 该兔单克隆抗体对氯霉素有很强的亲和性。当氯霉素浓度达到0.1ng/mL即可产生10%抑制率。而当浓度在1.06ng/mL时可产生50%的抑制率。氯霉素间接竞争ELISA标准曲线方程:标准曲线y=38.447x+49.082,R2=0.9924,线性良好。检测范围在0.18-6.37ng/mL之间,最低检测限是0.1ng/mL。同时该抗体对氯霉素具有较高的特异性,除了和琥珀氯霉素酸钠,甲砜霉素,氟甲砜霉素交叉反应率分别为2.09%,18.10%,12.45%外,和其他的喹诺酮类以及磺胺类药物均无交叉反应。 6样品回收率检测 该氯霉素单克隆抗体在猪尿样品检测中,回收率在73.31%-109.62%之间,变异系数介于6.98%-17.94%之间。在新鲜牛奶样品检测中,回收率在71.03%-95.01%之间,变异系数介于8.16%-16.93%之间。在蜂蜜检测中,回收率在71.10%-87.96%之间,变异系数介7.52%-14.74%之间。 上述试验表明,本实验建立的间接竞争ELISA法可满足检测需要,有潜在的应用前景。……   
[关键词]:氯霉素;人工抗原;重组抗体;兔单克隆抗体;ELISA;样品检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2011年