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药物与蛋白质的相互结合作用研究及应用

朱晓静

  蛋白质是生命系统中的基本物质,在生物的生命活动中起着极其重要的作用。任何药物进入生物体都需要蛋白质的运输,因此研究药物与蛋白质的相互作用机理,建立测定蛋白质的高灵敏度、低检测限、简单方便的测定方法具有现实意义,也是当前生物分析化学研究的热点之一。 本文利用分子荧光法、分光光度法、’H核磁共振波谱法、傅里叶变换红外光谱法等研究了十二种药物与蛋白质的相互作用机理。建立了以叶绿酸-a甲酯铜与叶绿素铜钠为共振瑞利散射探针测定人血清白蛋白含量的新方法,结果令人满意。本文主要分为四个部分: 第一部分:综述了研究蛋白质与药物相互作用的研究机理和方法;论述了共振瑞利散射法定量测定蛋白质的方法和进展。 第二部分:利用分子荧光法、分光光度法研究了25℃和37℃时五种喜树碱类药物:盐酸拓扑替康(TH),盐酸依利替康(IH),7-乙基喜树碱(ECPT),10-羟基喜树碱(HCPT)7乙基-10羟基喜树碱(EHCPT)与转铁蛋白(Tf)的相互作用机理,实验表明:五种喜树碱类药物对转铁蛋白的荧光光谱均有猝灭作用,且都为单一的静态猝灭过程。 25℃时结合反应的平衡常数K0(L·mol-1)和结合常数KB(L·mol-1)分别为K0(TH)=5.78×105,K0(IH)=4.82×104,K0(ECPT)=9.37×103,k0(HCPT)=4.01×106, K0(HCPT)=1.027×103;KB(TH)=1.66×104,,KB(IH)=7.35×104,KB(HCPT)=4.22×104, KB(HCPT)=1.72×104,KB(EHCPT)=3.34×104。根据Forster非辐射能量转移机理,求算了给体(Tf)与受体(喜树碱类药物)间的最短作用距离r分别为:r(TH)=3.77nm, r(IH)=3.78nm, r(ECPT)=3.62nm, r(HCPT)=3.92nm, r(EHCPT)=3.42nm。通过计算反应的热力学参数表明:盐酸拓扑替康与Tf结合主要作用力为氢键和范德华力;10-羟基喜树碱与Tf结合主要作用力为静电作用;盐酸依利替康,7-乙基喜树碱,7-乙基-10-羟基喜树碱与Tf结合主要作用力为疏水作用。利用’H核磁共振波谱法研究了EHCPT与转铁蛋白作用前后的核磁共振波谱,结果表明:EHCPT与Tf相互作用时,EHCPT进入Tf的疏水腔体中,10-OH和20-OH与Tf疏水腔体内表面的氨基酸残基发生相互作用,羟基发生了去质子化反应。 第三部分研究了四种磺胺类药物(磺胺嘧啶:SD,磺胺甲基嘧啶:SM1,磺胺二甲基嘧啶:SM2,磺胺甲基异噁唑:SMZ)及磺胺增效剂(甲氧苄胺嘧啶:TMP)与牛血清白蛋白(BSA)在25℃,30℃,37℃时的荧光猝灭作用。实验表明:25℃时平衡常数K0(L·mol-1)为:K0(SM2)=2.31×105, K0(SM1)=6.92×104,K0(SMZ)= 8.16×103,K0(TMP)=4.92×102, K0(SD)=3.32×105。结合点位数n分别为:n(SM2)=1.1758,n(SM1)=1.0332,n(SMZ)=1.0331, n(TMP)= 0.7461,n(SD)=1.2457。结合常数KB(L·mol-1)为:KB(SM2)=2.38×104,KB(SM1)= 3.21×104, KB(SMZ)= 3.96×103,KB(TMP)= 3.67×104, KB(SD)=3.07×104。药物与蛋白质的结合距离r(nm)分别为:r(SM2)=1.85, r(SMl)=2.80, r(SMZ)=2.59,r(TMP)=2.67,r(SD)=2.99。通过实验反应的热力学参数变化,表明其结合作用力类型分别为:磺胺甲基嘧啶,磺胺二甲基嘧啶,磺胺甲基异恶唑,磺胺嘧啶与BSA结合过程的主要作用力为氢键和范德华力。甲氧卞胺嘧啶与BSA结合过程的主要作用力为静电作用力。同时,我们用傅里叶变换红外光谱研究了BSA与SM1和SM2反应前后的光谱变化,实验表明:加入SM1、SM2后牛血清白蛋白的二级结构均发生了变化。 第四部分:研究了两种卟啉类化合物作为共振光散射探针测定人血清白蛋白含量的新方法。实验表明:叶绿素铜钠为共振散射探针的人血清白蛋白定量分析方法的检出限为:0.067mg/L,样品加标回收率为95.6%~102.3%。测定实际样品的人血清白蛋白含量为64.82g/L,RSD为1.78%,同一样品用流动注射-抑制化学发光法与考马斯亮蓝法进行了比对测定取得满意结果。利用叶绿酸-a甲酯铜为散射瑞利探针,方法检出限为0.0104g/L,加标回收率为99.14%~103.12%,测定实际样品HSA含量为61.09g/L,测定的RSD为1.6%。分子的聚集或分子量的增加可以增强散射强度,通过荧光猝灭实验得知HSA与叶绿素衍生物铜络合物发生了静态结合作用,因此产生了较强的共振瑞利散射。……