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共表达SHMT和TPase载体的构建以及双酶法合成L-色氨酸的研究

李鑫

  本研究构建了单表达丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)基因工程菌、单表达色氨酸酶(TPase)基因工程菌和共表达SHMT和TPase基因工程菌。利用乳糖诱导三种重组工程菌表达产酶,并优化诱导产酶的条件。利用重组基因工程菌进行两菌两次发酵产酶和单菌一次发酵产酶,采用双菌双酶法和单菌双酶法两种途径完成酶法合成L-色氨酸,并比较两种酶法合成L-色氨酸途径的特性。 1以大肠杆菌K-12基因组为模板,PCR扩增了编码SHMT和编码TPase的基因。将PCR产物纯化并回收,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切,回收酶切片段,并分别与同样经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切的质粒pET-28a载体相连接,构建重组质粒pET-SHMT和pET-TPase。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建单表达SHMT基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和单表达TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-TPase。 将已构建的质粒pET-TPase经BglⅡ和HindⅢ双酶切,并回收含有T7启动子和TPase基因的DNA片段。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切处理已构建的质粒pET-SHMT,并将纯化后的酶切产物与含T7启动子和TPase基因的DNA片段相连,构建共表达重组质粒pET-ST。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建共表达SHMT和TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST。 2以摇瓶发酵为基础,探讨了单表达SHMT、单表达TPase、共表达SHMT和TPase三种基因工程菌在乳糖诱导下的表达,研究了乳糖诱导浓度、诱导起始生长量、诱导培养温度、诱导培养时间对所产酶活性的影响。对于单表达SHMT基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT,其优化条件为:最适乳糖浓度8g/L;最佳起始生长量为OD600值达到1.0左右;最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6h。以最佳诱导条件培养工程菌,其产SHMT酶活达到220.7(U/mL),相比野生菌提高了6.4倍。 对于单表达TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-TPase,其优化条件为:最适乳糖浓度12g/L;最佳起始生长量为OD600值达到1.0左右;最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6h。以最佳诱导条件培养工程菌,其产TPase酶活达到113.7(U/mL),相比野生菌提高了8.4倍。 对于共表达SHMT和TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST,其优化条件为:最适乳糖浓度12g/L;最佳起始生长量为OD600值达到1.0左右;最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为6h。以最佳诱导条件培养工程菌,其产SHMT酶活达到210.2(U/mL),相比野生菌提高了6.1倍;其产TPase酶活达到93.5(U/mL),相比野生菌提高了6.9倍。 3双菌双酶法首先以单表达SHMT基因工程菌所产SHMT作为酶源,利用甘氨酸和甲醛为原料合成L-丝氨酸,甘氨酸的加入量为30g,甲醛以流加的方式加入,并利用其控制反应液的pH值在6.8~7.2之间。反应结束后收集L-丝氨酸反应液,并向其中加入9g吲哚,在单表达TPase基因工程菌所产TPase催化下,反应合成L-色氨酸。此途径甘氨酸的转化率为83.3%,吲哚转化率为92.5%,高效液相测定L-色氨酸的累积量为41.5g/L。 4单菌双酶法以共表达基因工程菌所产SHMT和TPase作为酶源,L-丝氨酸和L-色氨酸两步合成反应在同一反应罐中同时进行。设计三组不同的原料加入量,其中原料加入量为25g甘氨酸和7g吲哚时,原料转化率和产物累积量均较高,甘氨酸和吲哚的转化率分别为82.7%和82.9%,高效液相测定L-色氨酸的累积量为28.9 g/L。……   
[关键词]:丝氨酸羟甲基转移酶;色氨酸酶;共表达;乳糖诱导;双酶法合成L-色氨酸
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:武汉工业学院2010年