手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

黄鳝AR基因的克隆、表达及其蛋白的核质穿梭

周芳

  雄性激素在脊椎动物的性别分化以及雄性性征的维持中扮演重要的角色。雄性激素受体(androgen receptor, AR)作为雄性激素行使功能的载体,它的存在对雄性的发育同样有着重要的影响。 本论文旨在克隆黄鳝AR基因;分析AR基因在黄鳝性腺中的表达模式;研究黄鳝AR蛋白的亚细胞定位以及雄性激素对黄鳝AR蛋白的亚细胞定位的影响;最后对黄鳝AR蛋白的核质穿梭以及与配体结合序列进行了分析。主要研究结果如下: 1.黄鳝AR基因的克隆 利用DOP-PCR以及RACE PCR的方法,分别从黄鳝雄性性腺RNA模板以及雄性性腺文库中克隆到AR基因的全长编码区。多重序列比对显示,黄鳝AR与其它脊椎动物AR的转录激活结构域(TAD)和DNA结合结构域(DBD)结构域高度同源,有着一个高度变异的转录激活结构域,一个高度保守的DNA结合结构域,配体结合结构域(LBD)的前56个氨基酸与其他已知AR高度同源,而后59个氨基酸与其他物种区别较大。分子进化树分析显示,黄鳝AR蛋白与鱼类AR蛋白聚为一类,且与sea bass的AR蛋白有着最高的同源性。2.黄鳝AR基因在性腺组织的表达分析 通过RT-PCR的方法,从黄鳝的心、肝、脑、肾、脾及三种性别的性腺各个组织的RNA模板中检测黄鳝AR基因的表达。AR mRNA表达水平在肝脏、脾脏和雄性性腺中较高,而在脑和雌性性腺中表达量最低。荧光定量PCR进一步揭示了黄鳝AR基因在不同性别的性腺中的表达趋势,随着性腺由雌向雄的逐渐转变,黄鳝AR基因的表达呈现一个递增的趋势。 为了揭示黄鳝AR基因在性腺表达的细胞类型,运用组织切片原位杂交的方法检测到黄鳝AR基因主要在雄性性腺的生殖上皮内层表达,包括间质细胞、精原细胞以及精母细胞,雌性性腺中则在发育中卵细胞中表达,间性性腺的信号主要集中在退化中的卵以及精巢的生殖上皮内层。黄鳝AR基因表达呈现与黄鳝天然性反转过程相一致的时空差异,以及该基因在支持细胞和生殖细胞中的表达,暗示它在性别分化以及精子发生中的潜在重要作用。 3.黄鳝AR蛋白的入核以及核定位信号序列 与人类AR蛋白的一样,黄鳝AR蛋白转录激活功能的发挥以及核输入也需要雄性激素的刺激。雄性激素刺激是黄鳝AR蛋白入核的一个外在必要条件,另一个入核的内在必要条件是黄鳝AR蛋白本身含有一段核定位信号序列(NLS)。通过序列比对,在黄鳝AR蛋白的DBD结构域和Hinge结构域中发现一个保守的双极性的核定位序列448-RKCFEAGMTLGARKLKK-464.分别构建了含有NLS序列的和缺失NLS序列的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合的真核表达载体,以及NLS序列中定点突变真核表达载体。将构建的载体瞬时转染细胞后发现,含有NLS序列的真核表达载体其绿色荧光全部集中在细胞核中,而缺失NLS序列的突变体则均匀分布于细胞内。证实该RKCFEAGMTLGARKLKK序列为AR蛋白的功能性的核定位序列。核定位序列中的定点突变导致绿色荧光分布在胞质中,可以推出K461,463,464为AR蛋白入核的关键氨基酸。该NLS序列使得AR蛋白能进入核内并得以发挥调控下游基因转录的功能。 4.黄鳝AR蛋白的核输出信号序列 激素撤销实验证实黄鳝AR蛋白具有核输出的功能。缺失突变实验确定黄鳝AR蛋白特有的核输出信号序列定位于LBD结构域氨基酸序列553-575之间。进一步构建了绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合的含有NES序列的真核表达载体和缺失NES序列的真核表达载体,以及NES序列中定点突变真核表达载体。将构建的载体瞬时转染细胞后发现,含有NES序列的真核表达载体其绿色荧光全部集中在细胞质中,而缺失NES序列的突变体则全都分布在细胞核中,证实该序列为AR的功能性的核输出信号序列。然而核定位序列中亮氨酸和缬氨酸的定点突变表达载体与野生型AR表达载体比较,细胞定位并没有发生明显的变化,说明这些突变的氨基酸并不是核输出序列的关键氨基酸。LMB处理实验证明黄鳝AR的核输出并不是由CRM-1介导的。该NES序列使得AR在没有激素存在的情况下得以保持在细胞质中,有利于激素对雄性生殖发育的调节。 5.黄鳝AR蛋白的激素结合序列 利用Geno3D软件预测了黄鳝AR蛋白LBD结构域的三级结构。3D模型图显示黄鳝AR LBD结构域含有5个α螺旋,其中螺旋eH3,eHH4和eH5在空间结构上组成一个配体结合所需的凹槽。但是与人类AR中形成凹槽的三个关键α螺旋比较,黄鳝AR相对应的这三个α螺旋在螺旋结构上要短很多。比较黄鳝AR蛋白与人类AR蛋白转录活性,以及小鼠AR蛋白和黄鳝AR蛋白的亚细胞定位,实验结果提示黄鳝AR与雄性激素分子DHT的结合能力弱于人类和小鼠AR与雄性激素分子结合能力。螺旋eHH5的缺失突变体和定点突变体以及螺旋eHH4的定点突变体转染细胞,结果显示在激素处理后,突变体的转录活性以及亚细胞定位均没有发生明显变化,说明螺旋eH4和eHH5与DHT分子的结合密切相关。序列比较显示人类AR蛋白LBD结构域H3序列和黄鳝AR蛋白LBD结构域eH3序列非常保守,人类AR蛋白H3序列中的突变导致AR蛋白丧失与激素结合的功能,同时位于非螺旋区的另一突变体也对DHT的刺激也不敏感,说明黄鳝AR蛋白LBD结构域中553-588这一段氨基酸序列可能对DHT的结合都很重要,它们的存在对LBD结构域是否能形成正确的空间构象非常关键。……   
[关键词]:黄鳝;AR基因;间质细胞;核定位信号;核输出信号;配体结合
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:武汉大学2010年