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枯草芽孢杆菌酯酶的发现及其催化制备l-薄荷醇的研究

郑高伟

  薄荷醇是全球三大香料化学品之一,广泛用于医药、食品、烟草、化妆品及口腔保健等产品,年产量超过2万吨,价值高达5亿美元。由于受天气、地域的影响及全球经济的迅速发展,天然薄荷醇已经无法满足人类的需求。近年来,利用生物催化手性拆分技术制备l-薄荷醇的研究,引起了学术界和工业界的广泛关注。这主要是由于生物催化反应具有高效、高选择性、副产物少、安全和环境友好等优点,可以与化学合成反应相结合,相互取长补短,优势互补。 本文以目标反应为导向,依托高效的薄板层析和精确可靠的气相色谱分析技术,筛选出一株新型的生物催化剂——枯草芽孢杆菌,它能够高选择性地催化水解dl-乙酸薄荷酯生成l-薄荷醇,并具有高底物耐受性的优点;以此菌株为材料,对其催化反应的条件进行了详细的研究;对该菌细胞中的目标酯酶进行了克隆表达及蛋白纯化;利用重组酯酶在2L规模进行了l-薄荷醇的扩大制备,并对重组酯酶进行了固定化研究。论文的主要工作包括以下四个部分内容: 第一,新颖高效生物催化剂的定向筛选。以待拆分底物dl-乙酸薄荷酯作为富集培养的唯一碳源,以目标产物(l-薄荷醇)作为筛选导向,依托高效的薄板层析和精确可靠的气相色谱分析技术,从富集培养得到的261个微生物菌落中,初筛得到98株具有目标反应活性的菌株,通过对其中活性较高的81株酯酶产生菌的复筛,获得16株对目标底物转化较好且所得产物光学纯度在90%以上的菌株。通过16株候选菌株底物耐受性的进一步考察,最终筛选到一株既具有高选择性又能水解高浓度底物的最优生物催化剂。该菌经16 S rDNA鉴定,确定为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis ECU0554,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC No.2548。 第二,枯草芽孢杆菌酯酶(Bacillus subtilis esterase,简写为BSE)催化特性的研究。确定BSE的最适底物为乙酸薄荷酯,最佳反应温度为30-C,最佳反应pH为7.0。在最适的反应条件下,它能够高度对映选择性地催化水解外消旋混合物中的l-薄荷酯,对映体选择率(E)高于200,所得产物的光学纯度(eep)在95%以上。此外,它还显示出较强的底物耐受性,底物浓度可达100g/L。这些特性显示该酶具有较好的实际应用前景。 第三,BSE的基因克隆、异源表达及其所催化反应的优化。将基因重组后的枯草芽孢杆菌酯酶(Recombinant Bacillus subtilis esterase,简写为rBSE)在大肠杆菌中进行了高效表达,提高了rBSE的产酶效率,单位体积的发酵活力提高了两个数量级,每升发酵液的酯酶活力达到19万单位,使其成为一种廉价易得的生物催化剂。底物特异性研究表明,rBSE对短链脂肪酸底物的水解活性较高,证明该酶确实是一种酯酶。相对于野生型BSE,rBSE催化的反应具有更好的结果,底物浓度从100g/L进一步提高到200 g/L,而催化剂用量却从50 g/L减少到2.5 g/L,使得底物与催化剂的比率(S/C)提高了40倍;时空产率和(gprod/L/d)和比产量(gprod/gcat)分别提高了4倍和75倍。利用rBSE作为生物催化剂,在升级规模对dl-乙酸薄荷酯进行了酶促拆分,实现了l-薄荷醇的扩大制备。这说明了rBSE用于l-薄荷醇的制备在技术上的切实可行性,具有很好的应用开发前景。 第四,重组酯酶(rBSE)的固定化研究。采用操作简单、酶活回收率高、且不需要载体的酶聚集体交联固定化技术(Cross-linked enzyme aggregations,简称CLEAs),成功地对rBSE进行了固定化。交联固定化后该酯酶(Cross-linked aggregations of recombinant Bacillus subtilis esterase,简写为CLA-rBSE)的热稳定性得到很大的提高,在50℃和30℃的半衰期分别提高了14倍和360倍。CLA-rBSE也表现出良好的操作稳定性,在dl-乙酸薄荷酯的酶促拆分反应中,重复使用10批次后,活力损失仅有8%,显示出很好的工业应用价值。……   
[关键词]:生物催化;手性拆分;酶促水解;枯草芽孢杆菌酯酶;乙酸薄荷酯;l-薄荷醇
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华东理工大学2011年