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TRAIL与LDM联用和作用机制及TRAIL蛋白的表达

杨杰

  第一部分力达霉素联合TRAIL对人非小细胞肺癌的协同作用及其相关机制研究 背景与目的:研究烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)联合作用对人非小细胞肺癌H460细胞的增效作用及其作用机制。方法:采用MTT法观察LDM和/或TRAIL联合用药对非小细胞肺癌细胞系H460细胞增殖的抑制作用。利用Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术和Hoechst33342荧光染色方法检测两药联合对细胞凋亡的影响。采用Western blot检测在不同浓度LDM作用条件下TRAIL受体DR4、DR5的表达情况和凋亡通路中PARP、Caspase3和Caspase8分子的变化。结果:LDM和TRAIL均能够抑制人非小细胞肺癌H460细胞的增殖,MTT结果显示,两药联合抑制效果增强,其CDI<1,具有协同作用。LDM与TRAIL单独用药IC50值分别为4.60×10-10mol/L和915ng/mL,LDM与TRAIL两者联合后作用效果增强,在50 ng/mL、100 ng/mL TRAIL浓度下LDM的IC5o值分别为3.06×10-11mol/L和1.61×10-11mol/L。荧光显微镜下观察在50 ng/mL TRAIL或1×10-10mol/L LDM作用8 h下H460细胞少量凋亡,而两者联合作用下绝大部分H460细胞均已凋亡。两药单独作用以及联合作用于H460细胞12小时后,1×10-10mol/L LDM作用组的细胞凋亡率为26.1%,50 ng/mL TRAIL作用组的细胞凋亡率为62.3%,联合作用组的细胞凋亡率为74.7%,显著高于对照组。与单独用药组相比,联合用药组中caspase-3和caspase-8的活性明显增强,因此,联合用药组中H460细胞的凋亡率也明显增加。Western blot结果显示LDM能够增强TRAIL受体DR5的表达,不仅有剂量依赖性,且时间越长,表达量越高。而LDM在时间和浓度上对TRAIL受体DR4的表达却几乎没有影响。结论:LDM对人非小细胞肺癌H460细胞具有生长抑制作用,并能够通过诱导DR5表达而促进TRAIL引起的肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加细胞对TRAIL的敏感性。 第二部分TRAIL蛋白的构建表达及生物学活性研究 背景与目的:本研究的目的是从人胎盘组织中获取TRAIL基因,并在大肠杆菌中大量表达,分离纯化后对其相关生物学活性进行检测。方法:采用两步法RT-PCR从胎盘组织中获取TRAIL基因,采用PCR扩增和DNA克隆技术获得sTRAIL序列,并在3’端插入组氨酸标签编码序列。将该重组基因经过双酶切后插入到pET30a(+)表达载体中,得到重组表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)starTM中,加入0.2mmol/L IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。裂解菌体后可得到包涵体,包涵体变性后采用Ni2+亲和层析法分离纯化得到目的蛋白,Western Blot对纯化出的融合蛋白进行鉴定。产物采用ELISA检测了其与受体的结合活性。结果:经过RT-PCR得到了TRAIL基因,将其插入到表达载体后成功实现了在大肠杆菌中的表达。产物主要以包涵体的形式存在于大肠杆菌中,Ni2+亲和层析对其进行分离纯化,得到的目的蛋白量为每升发酵液得到3 mg活性蛋白。Western blot证实了纯化的蛋白为带有His-tag标签的目的蛋白。ELISA结果显示蛋白对人非小细胞肺癌H460细胞有很强的结合活性。结论:本研究成功获得了TRAIL基因,构建表达了C末端含有His-tag标签的sTRAIL蛋白,并成功从包涵体中分离纯化得到目的蛋白,ELISA检测其对H460细胞结合活性良好。……