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阿胶低肽及其制剂的研究

付英杰

  本文采用生物酶解法得到阿胶的药效物质。以药效学为指标,确定了口服用及注射用阿胶低肽的有效分子量及安全分子量范围,并考察了其量效关系;以低肽含量为指标,进行了单因素考察,在此基础之上,以正交实验设计优选了阿胶酶解工艺;以膜分离技术对酶解液进行了纯化,考察损失率以优化其精制工艺,并制成了口服用及注射用阿胶低肽冻干粉;以Sephadex、HPCE、HPLC等各种技术,对阿胶低肽冻干粉溶液进一步分离后,分别以SDS-PAGE、细胞培养法进行谱效关系的研究、以HPLC-MS法对其有效峰进行结构研究;最后对制剂进行了安全性检查、药效学研究及质量标准研究。 以致敏活性为指标,通过实验确定了口服用低肽有效分子量范围为<5kD,注射用低肽安全及有效分子量范围为1kD-3kD。<5kD分子量范围的阿胶低肽,其剂量与药效在5mg·kg1-15mg-kg-1范围内呈正相关,1kD-3kD分子量范围的阿胶低肽,其剂量与药效在1mg·kgl-20mg·kg-1范围内呈正相关。 阿胶低肽优选制备工艺为:口服用低肽的酶解工艺:酶解温度为42℃、胃蛋白酶酶解pH为2.0、胃蛋白酶酶量10万U·g-1、胃蛋白酶酶解时间为1.5小时、胰蛋白酶酶解pH为8.0、胰蛋白酶酶量为5千U·g-1、胰蛋白酶酶解时间为2.5小时;注射用阿胶低肽的酶解工艺:酶解温度为42℃、胃蛋白酶酶解pH为2.0、胃蛋白酶酶量10万U·g-1、胃蛋白酶酶解时间为2小时、胰蛋白酶酶解pH为8.0、胰蛋白酶酶量为5千U·g-1、胰蛋白酶酶解时间为3小时;超滤工艺:取50g阿胶粉制成阿胶低肽酶解液,稀释至1000mL,水浴预热至40℃,在柱压0.15±0.01MPa下分别经过截留分子量30kD、5kD(口服用)、3kD(注射用)的超滤膜超滤,并水洗一次。 口服用阿胶低肽无异常毒性,为实际无毒物质;注射用阿胶低肽无明显致敏性,无毒副作用,无热原反应。采用4种常见贫血模型(相当于临床上常见的长期中毒性、失血性、化疗性、放疗性贫血);证实阿胶低肽对不同类型的贫血具有不同程度的改善作用;小鼠负重游泳实验和血清尿素氮及肝糖原测定表明,阿胶低肽具有一定的抗疲劳作用趋势;小鼠免疫增强实验表明,阿胶低肽可提高小鼠循环抗体血清溶血素水平、增强DNCB诱导小鼠DTH反应,从而对机体体液免疫、细胞免疫发挥作用;此外,对非特异性免疫巨噬系统也有一定的促进作用。 通过澄清度、pH、密度及纯度检测可以检验口服用阿胶低肽的质量。通过检查可见异物、不溶性颗粒、pH、分子量范围、纯度(或低肽含量)及升血效价可以检验注射用阿胶低肽的质量。通过对阿胶低肽及其几个组分的Tricine-SDS-PAGE研究,确定了阿胶低肽成品制剂的分子量在2kD以下,可作为阿胶低肽定性鉴别的方法。稳定性实验表明,存储于西林瓶中的注射用阿胶低肽冻干粉可于4℃下存储2年。 在完成阿胶低肽制剂的基础上,进一步研究了其成分及结构。首先用分子筛将阿胶低肽分成3个组分;然后将几个组分进一步纯化后进行了细胞培养,同时研究了其中肽含量较多的2号及3号峰的HPLC分析方法;从而得出2号峰是有效组分的结论;最后将2号峰进行HPLC-MS检测,通过SEQUEST和Mascot两种搜索引擎进行搜索,得出了2号峰中可能含有的肽碎片序列。……   
[关键词]:阿胶;低肽;冻干粉;酶解;升血;质量标准;谱-效关系
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东中医药大学2010年