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基于单域重链抗体的天然噬菌体文库的构建及抗DON适配体的淘选

涂追

  重链抗体是一种存在于骆驼、鲨鱼等动物中天然缺失轻链的抗体,仅由其可变区组成的抗体称为单域重链抗体。单域重链抗体分子量小(约15 kDa),具有易表达、高水溶性、耐高温、耐极度pH值等独特性质,目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。在食品安全检测领域单域重链抗体也展现出广阔的发展前景。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名呕吐毒素(vomitoxin,VT),属于单端孢霉烯族真菌毒素,主要是由某些镰刀菌产生。该毒素常出现于谷物及其加工产品中,许多国家和地区都检测到了DON的污染。DON会引起动物增重下降、食欲减退、营养吸收率降低,并影响免疫功能。目前大部分国家对食品、谷物、饲料中的DON含量都做了严格规定。 免疫学检测方法具有灵敏、快速等特点,适合大批量样本的检测。现有的DON免疫学检测方法大多采用传统的抗体制备技术(多克隆抗体和单克隆抗体),需要多次反复免疫动物,制备过程繁琐,来源有限,生产成本较高。以抗体库技术为代表的第三代基因工程抗体技术为快速、低成本的获取和生产抗体提供了强有力的支撑。 本研究采用未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)的免疫细胞作为实验材料,根据重链抗体保守序列设计引物,建立基于重链抗体可变区基因的天然噬菌体展示文库,并以DON-MBSA人工抗原为配基,对构建的文库进行了淘选,主要研究结果如下: 1以羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,分别采用半巢式PCR法和巢式PCR法构建了两个单域重链抗体初级文库SNAL和NAL,两者的实际库容量均达到107,经辅助噬菌体救援后获得噬菌体展示文库SNA-PDL和NA-PDL,滴度达1013cfu/mL。文库多样性分析结果显示,文库具有良好的多样性,可以用于后续淘选。 2通过三轮淘选,从噬菌体文库SNA-PDL中淘选出了三类能与DON特异性结合的克隆,分别为DON-binder 1:B9、B10、B11、B13、C3、C8、C10、C15; DON-binder 2:C11; DON-binder 3:A4、A9。间接phage-ELISA检测结果显示,前两类克隆的OD450测定值可达后一类克隆OD450值的7~10倍,提示亲和力较高。从天然噬菌体文库NA-PDL中淘选获得了两种可以与DON-MBSA结合的单域重链抗体,其中一种可以与DON特异性结合。 3在大肠杆菌表达系统中对重组噬菌粒pHEN-B9进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在诱导培养上清中存在预期大小的蛋白(约50 kDa)。竞争ELISA法分析诱导表达上清,结果表明诱导表达上清可以抑制抗DON单克隆抗体与人工抗原的结合,提示培养上清中的表达产物能与DON发生特异性结合,有望替代抗DON单克隆抗体。 本研究的主要创新之处: 1采用针对羊驼(Lama pacos)重链抗体设计的引物,分别以巢式PCR法和半巢式PCR法扩增羊驼重链抗体可变区全套基因,构建了两个天然噬菌体文库SNA-PDL和NA-PDL,该文库可以作为通用的技术平台,重复用于多种抗原的筛选。 2从天然噬菌体文库SNA-PDL中淘选获得了三种可以与DON特异结合的克隆,选取其中一种结合力较强的克隆在大肠杆菌中表达,结果表明,能够表达出具有DON结合活性的蛋白,有望将其应用于DON免疫学检测方法的建立。从天然噬菌体文库NA-PDL中淘选获得了一种可以与DON特异性结合的单域重链抗体。……   
[关键词]:脱氧雪腐镰刀菌烯醇;单域重链抗体;噬菌体展示文库;phage-ELISA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南昌大学2010年