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乳链菌肽耐受性调控新基因功能的研究

轩辕铮铮

  Nisin是由N血清型乳酸乳球菌产生的一种高度翻译后修饰的多肽类细菌素。作为一种对人体无毒害的天然防腐剂,它被广泛地应用于食品工业、造纸、农业饲料、生殖避孕、医学移植等领域。 Nisin可以抑制绝大多数革兰氏阳性菌,主要通过抑制细胞壁合成,形成穿膜孔道引起胞内小分子物质外泄,诱导细菌自溶酶释放或抑制孢子形成四种方式。为避免对自身菌体的破坏,由Nisin基因簇编码的NisI和NisFEG四个蛋白协同作用,为产Nisin的乳酸乳球菌提供了免疫保护。但近几年的研究表明,不的Nisin的乳酸乳球菌也可以被诱导产生对Nisin的耐受性,说明Nisin的免疫耐受系统是一个复杂的调控网络。除了Nisin基因簇中的基因,乳酸乳球菌中还有很多基因参与免疫耐受性的调控。 本文选用一株Nisin高产的乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. lactis N8作为研究对象,利用人工Mu转座技术构建了含有1,800个突变子的文库。从突变文库中筛选到一株Nisin免疫耐受性显著增高的突变株,命名为L31。通过基因克隆、测序和遗传定位,确定这个突变株Mu转座子DNA插入的是一个功能末知的基因irpTo 为了探索irpT基因参与Nisin免疫耐受调控网络的可能机制,我们进一步研究了它的生物学功能。首先,通过Southern杂交确定了突变株L31基因组中Mu转座子DNA插入的唯一性,并使用同源基因序列分析和遗传互补实验排除了极性效应的可能。比较分析irpT基因序列以及它编码的蛋白质的基序,结果显示它是一个具有跨膜结构的膜蛋白,可能与细菌的抗菌素抗性有关。Western blotting结果显示,IrpT蛋白不是通过影响免疫系统中的NisI和NisFEG来改变Nisin的免疫耐受的。双向电泳结果显示,IrpT蛋白的缺失造成5个蛋白的表达量的显著改变:磷酸转运蛋白的表达量明显降低,而dTDP-L-鼠李糖合成酶、磷酸丙酮酸水合酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和一个未知功能蛋白的表达量明显升高。对编码这些蛋白的基因的转录水平进行研究,结果显示irpT基因插入失活对这5个基因的影响与蛋白表达水平一致。说明irpT基因是通过影响上述5个基因的表达来改变乳酸乳球菌对Nisin的耐受性。 细胞壁合成与细菌素抗性的关系最为密切和直接,而dTDP-L-鼠李糖合成酶正是细胞壁骨架上多糖链的合成酶之一。检测突变株L31细胞壁鼠李糖的含量显示比野生株高13.7%,而且在Nisin敏感的乳酸乳球菌MG1363中过表达dTDP-L-鼠李糖合成酶会提高该菌对Nisin的耐受性。证实了irpT基因会通过影响dTDP-L-鼠李糖合成酶的表达来改变乳酸乳球菌对Nisin的耐受性。 通过对Nisin耐受相关新基因的深入研究,可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制,为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。……   
[关键词]:乳酸乳球菌;Nisin;免疫耐受;人工Mu转座技术
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南开大学2010年