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莲藕中抗氧化成分的抗HIV-1活性及其作用机制研究

江筠

  天然产物一直是药物和药物先导化合物的重要来源。已有研究表明,抗氧化、抗HIV-1和免疫调节三者之间存在着密切的关系。本研究首先以抗氧化为筛选指标,以人们日常食用的莲藕为研究对象,用大孔树脂NKA从莲藕粗提物L中分离到三个组分L1、L2和L3,活性产物在L2中富集。进一步采用葡聚糖凝胶LH-20从L2中分离到7个组分,分别命名为L2a-L2g,其中L2c和L2f显示出较高的抗氧化活性。经高效液相色谱从L2c中纯化出单一组分L2c-3,从L2f中纯化出单一组分L2f-2和L2f-3。通过质谱、红外光谱、核磁共振等方法确定L2c-3为色氨酸(tryptophan)、L2f-2为没食子儿茶素[(+/-)-gallocatechin]、L2f-3为儿茶素[(-)-catechin]。反应浓度为250μg/ml时,L2c-3、L2f-2和L2f-3对红细胞氧化溶血的抑制率达75.39%、80.26%和79.09%。L2f-2和L2f-3在此浓度下,抑制脂质过氧化率达75.42%和74.48%,显示出极强的抗氧化活性。此外,L2f-2和L2f-3对超氧阴离子具有较强的清除活性(IC50分别为126.2 gM和204.8μM),同时它们还可以有效清除羟基自由基(其ICso分别为102.0μM和234.4μM)。采用50%(v/v)和67%(v/v)的乙醇对莲藕粗品L进行分步沉淀,得到两个组分LA和LB,其中LB的抗氧化活性远高于LA。用葡聚糖凝胶Sephadex G75从LB中分离到两个单峰LBl和LB2,其中LB2为活性成分。用凝胶层析确定LB2的分子量约为18.8 kD。经化学分析,LB2糖含量为40.7%、蛋白含量33.4%,由此推测为多糖蛋白复合物。通过多糖水解和单糖PMP衍生的方法测定LB2中的多糖部分是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖,按摩尔比2:8:7:8:1组成。红外光谱分析表明LB2是一种同时具有α-和β-吡喃型单糖以及α-呋喃型单糖的硫酸酯多糖。生物活性实验结果显示,LB2的抗氧化活性比粗品提高了3倍,其对红细胞氧化溶血的抑制率为72.2%(125μg/ml),对脂质过氧化的抑制率为83.2%(250μg/ml)。 HIV-1整合酶(IN)是逆转录病毒特有的酶,在人体内没有同源类似物,是抗HIV-1药物研究的重要靶点,但目前被FDA批准上市的32种抗HIV-1药物中仅有一种是IN抑制剂。IN抑制剂研究缓慢的重要原因之一就是筛选模型的缺乏。本研究通过创新性设计,构建了以HIV-1 IN 3’切割活性为靶点的新型N抑制剂体外筛选模型和胞内双质粒IN抑制剂筛选模型。在体外筛选模型中,首先通过双重PCR技术在IN中引入两个突变位点F185K和C280S,在大肠杆菌中实现IN的可溶性表达,利用NTA-Ni2+亲和柱从菌体裂解液上清中纯化带His标签的IN,用Western Blot检测确认。重组IN不依赖其他细胞蛋白即可对底物质粒pLTR进行3’切割使其线性化。通过DNA电泳,用凝胶成像系统分析不同构性质粒光密度的变化,计算样品对IN的抑制率。用此模型检测,莲藕中大分子LB2抑制IN的ICso为5.28μM,显示出极强的抗IN作用。同时莲藕中小分子L2f-2(IC50:412.45μM)和L2f-3(IC50:432.40μM)也具有比IN抑制剂标准品Raltegravir (IC50:686.17μM)更强的抗IN活性。在胞内双质粒IN抑制剂筛选模型中,通过利用96孔板-两步生长法测定样品对双质粒菌生长的抑制作用,从而间接显示抗IN活性。用此模型检测,LB2在反应浓度为10μM时对IN的抑制率为47.48%,高于标准品Raltegravir。L2f-3在反应浓度为100μM时,也显示出较高的对IN的抑制作用,其抑制率为48.78%。用MTT法检测样品毒性发现,在相同反应浓度下,Raltergravir处理的正常细胞存活率不到20%;而L2f-3和LB2处理的细胞存活率高达100%,未显示出任何细胞毒性。这两个模型具有操作简单、成本低、检测快速、重复性好等优点,适合大规模筛选IN抑制剂。 本研究首次证明了莲藕活性成分的抗HIV-1多效性。HIV-1逆转录酶(RT)和蛋白酶(PR)也是抗艾滋药物研究的有效靶点。L2f-2、L2f-3和LB2均可以有效抑制RT活性,其IC50分别为10.41μM、9.58μM和33.70μM。同时,在反应浓度为70μg/ml时,L2f-2和L2f-3对PR的抑制率达17.61%和15.66%,而市售蛋白酶抑制剂标准品pepstatin A的抑制率仅为7.36%。细胞免疫功能的恢复作为免疫重建的重要组成部分,在对HIV-1感染者的治疗中起着重要的作用,而细胞因子是衡量细胞免疫功能的重要指标。本研究通过Real-time PCR的方法检测莲藕活性成分对重要细胞因子的影响。结果显示,L2f-2和L2f-3可显著上调Bal b/c小鼠脾细胞IL-2和IL-6基因表达水平,同时下调IL-10的表达水平。这种调节可提高细胞免疫应答水平,有利于细胞抵御病毒感染。L2f-3还可以通过下调TNF-a的表达和抑制Tat对病毒LTR的激活直接抑制HIV-1的复制。LB2可以上调Bal b/c小鼠腹腔巨噬细胞IL-2、IL-4和IL-10的表达,从整体上激活免疫系统,有利于改善HIV-1感染后细胞因子普遍降低的状态,维持机体免疫平衡。LB2对TNF-a表达的下调作用使其具有可直接抑制HIV-1复制的能力。 本研究首次构建了两种新型HIV-1 IN抑制剂筛选模型,并从抗氧化、抑制HIV-1关键酶、细胞因子调节三方面研究了莲藕中活性成分抗HIV-1作用的机制。与化学合成药物相比,这些天然产物具有更高的抗HIV-1活性和更低的细胞毒性,其抗HIV-1作用的多效性克服了化学合成药物易因病毒株变异而失效的缺点,为开发新型抗HIV-1药物奠定了基础,具有很好的应用前景。……   
[关键词]:HIV-1整合酶;筛选模型;莲藕;抗氧化;细胞因子
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南开大学2010年