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新等位基因HLA-B~*15:133的鉴定、重链胞外区多肽的原核表达及特异性单克隆抗体的制备

王琳

  第一部分:HLA‐B1*15:133的发现和确认及其家系研究 目的:介绍新等位基因HLA‐B*15:133的发现和确认过程,并对新等位基因的供者家系进行血清学分型和基因学分型的研究。 方法:使用HLA基因分型PCR‐SSO和PCR‐SBT技术对人群进行HLA分型。使用血清学和SBT技术对拥有HLA‐B*15:133新等位基因的供者进行家系分析。 结果:发现一个新等位基因与HLA‐B*15:18:01在第419位相差一个核苷酸,C‐>T,即Codon116位TCC‐>TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。报告呈递给国际HLA命名委员会,最终确定命名为HLA‐B*15:133。血清学表达B71(70)抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。 结论:利用HLA分子生物学分型技术在大样本的筛查下发现了新等位基因并命名为HLA‐B*15:133。家系分析后得出HLA‐B*15:133表达B71(70)抗原,且供者的新等位基因遗传于他的母亲。 第二部分:HLA‐B*15:133基因原核细胞表达载体的构建及鉴定 目的:构建HLA‐B1*15:133重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,并鉴定其在原核细胞中是否表达。 方法:用RT‐PCR的方法从人外周血淋巴细胞的mRNA中逆转录扩增出HLA‐B*15:133的cDNA,设计带有酶切位点的特异性引物扩增新等位基因编码膜外多肽的第2、3、4外显子,经Bam HI和Hid III双酶切,插入表达载体pET30a(+)。将构建成功的表达载体转染原核细胞E.coli,运用western‐blotting鉴定是否表达。 结果:表达载体pET30a(+)‐ B*15:133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。 结论:利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a(+)‐ B*15:133,可在原核细胞中大量表达。 第三部分:制备并鉴定抗新等位基因HLA‐B*15:133的单克隆抗体 目的:制备抗新等位基因HLA‐B*15:133重链膜外多肽的小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为进一步研究等位基因HLA‐B*15:133的生物学功能提供基础。 方法:选择三条具有亲水性和特异性的HLA‐B*15:133肽链交联在大分子载体牛血清白蛋白(BSA)和匙孔型血蓝蛋白(KLH)上,采用KLH交联物用于Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备特异性抗HLA‐B*15:133的单克隆抗体,并通过ELISA方法和WB方法测定单克隆抗体特异性和识别原核表达的新等位基因HLA‐B*15:133的胞外多肽。 结果:通过细胞融合、ELISA筛选、克隆化和亚克隆获得识别多肽的6株可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中一株可以识别原核表达的蛋白,WB在40KD附近可见清晰条带。6株单抗的亚型,2株为IgG1/kappa,2株为IgG2a/kappa,1株为IgG3/kappa,1株为IgM/kappa。 结论:获得1株特异性相对较好、能识别多肽的杂交瘤细胞株,这为进一步研究HLA‐B分子的功能性研究提供了有用的工具。……   
[关键词]:新等位基因;HLA‐B*15;PCR‐SSO;PCR‐SSP;PCR‐SBT;原核表达;表达载体;杂交瘤;单克隆抗体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京市结核病胸部肿瘤研究所2010年