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富苯丙氨酸碱性短肽的发现及其对蛋白质等电点和免疫交叉反应的影响

徐军

  每种蛋白质都具有特定的构象,表现为每种蛋白质有特定的等电点(pI)。但许多蛋白质如乙醇酸氧化酶(GO)等却表现出多个等电点,表明同一蛋白质具有不同构象;另外,不同蛋白质之间经常有免疫交叉反应,表明不同蛋白质又具有类似构象。目前不清楚蛋白质表现出多个等电点和具有免疫交叉反应的机理,更不清楚这两者是否有关联,以及蛋白质出现多个等电点具有什么样的生物学意义。本论文就此开展相关研究, 主要结果如下: (1)经纯化获得菠菜绿叶乙醇酸氧化酶,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为40 kDa单带。该乙醇酸氧化酶在二乙基氨基-离子层析中被快速洗脱,表明其为碱性;醋酸纤维素薄膜电泳的结果也证实其等电点大于10.0,为碱性。但该乙醇酸氧化酶经等电聚焦电泳和毛细管等电聚集,每次结果不同,或不聚焦,或聚焦出多个等电点,或分散在3.25-10.0很宽的范围;经双向凝胶电泳,每次结果均显示其大小为40 kDa,但每次结果其等电点均不同,或是3.6,或是9.6;或在3.6-9.6之间。以上结果表明纯化的乙醇酸氧化酶实际上是由乙醇酸氧化酶和一个碱性未知蛋白质(X)组成的复合体(GC)。 (2)GC经制备性SDS-PAGE,在正极凝胶中只有40 kDa。该40 kDa蛋白质和GC的氨基酸组成存在显著差别,即40 kDa蛋白质不含有苯丙氨酸,而GC富含苯丙氨酸。十二烷基磺酸钠-醋酸纤维素薄膜电泳(SDS-CAME)证实未知蛋白质X是向负极泳动的,其苯丙氨酸含量高达60%,碱/酸氨基酸的比例为1.46,即X是一个富苯丙氨酸的碱性蛋白质(basic heylalanine-rich protein,BP)。将GC进行十二烷基磺酸钠-毛细管电泳(CE-SDS),结果出现近30个分子量大小在12.81-39.96 kDa之间的峰,每两个峰分子量的大小差别为2 kDa或2 kDa的整数倍,表明BP可能是由大小为2 kDa左右的富苯丙氨酸碱性肽(basic pheylalanine-rich oligo-peptide,BOP)聚合而成。 (3)将GC进行全波长扫描,发现其在258 nm处有吸收峰;GC经SDS-PAGE,所出现的GO 40 kDa亚基不被GC抗体所识别,只被GO 40 kDa亚基抗体所识别;将GC进行酸处理或放置处理后,乙醇酸氧化酶活性明显降低,与GC抗体所作的斑点杂交(Dot blot)反应强度随着放置时间延长而下降,但SDS-PAGE图谱没有变化。以上结果说明BP可能通过疏水作用等非共价键形式结合在乙醇酸氧化酶外部,并与乙醇酸氧化酶呈现出不规则不彻底解离的特点。 (4)从用不同生物材料(包括兔、鸡、中国对虾、唐鱼、蚕、水稻和微生物如大肠杆菌等)获得的粗蛋白质中均发现含有向负极泳动的BP,此结果表明该现象在生物界可能具有普遍意义。 (5)通过相似手段进一步证实菠菜1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶和菠萝蛋白酶呈现多个等电点和免疫交叉反应的原因,可能与BP有关。 因此,本论文的研究结果较好地解释了一种蛋白质呈现出多个等电点以及多克隆抗体存在免疫交叉反应的现象。……   
[关键词]:苯丙氨酸;碱性短肽;等电点;免疫交叉反应
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华南理工大学2010年