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酒明串珠菌不对称合成手性醇及其反Prelog脱氢酶的酶学特性研究

孟凡涛

   光学纯的手性醇是化学合成中广泛应用的重要手性砌块,其中(R)-和(S)-2-辛醇是合成类固醇、昆虫性外激素(生物杀虫剂)等光学活性药物和农药的中间体,特别是制备高性能液晶及液晶组件不可或缺的原料。利用微生物醇脱氢酶(ADH)对潜手性酮进行不对称还原制备单一对映体的手性醇是当前手性合成的研究热点,因其具有立体选择性好、理论产率高(100%)、环境友好等的特点。论文以本研究室筛选到的一株不对称还原2-辛酮生成(R)-2-辛醇的酒明串珠菌Oenococcus oeni CECT 4730为基础,着眼于工业化生产,以时空产率为目标,采用原位分离技术构建了新的水/有机溶剂两相反应系统,对全细胞不对称制备(R)-2-辛醇进行研究,并对O. oeni CECT 4730中起关键催化作用的反Prelog规则(R)-ADH进行了分离纯化和酶学性质研究。主要工作及取得的结论如下: (1)通过比较酒明串珠菌O. oeni CECT4730在6中常见明串珠菌培养基上生长和产(R)-ADH的情况,发现ATB培养基为最适的发酵培养基类型。通过Plackett-Burman试验选出ATB中对该菌发酵产酶具有显著正效应的3个因素,按其重要性依次为:番茄汁、酵母膏、柠檬酸氢二铵。并且发现ATB培养基中番茄汁浓度较高时,其对O. oeni CECT4730发酵产(R)-ADH的促进作用比对细胞生长的促进作用更为明显。通过响应面分析确定了各显著性影响因素的最优水平,从而确定了O. oeni CECT4730发酵培养基的最适配方为:葡萄糖1%、蛋白胨1%、盐酸-L-半胱氨酸0.05%、MgSO_4·7H_2O 0.02%、MnSO_4·4H_2O 0.005%、吐温80 0.1%、番茄汁23.8%、酵母膏0.52%、柠檬酸氢二铵0.34%,pH 4.9。与优化前相比,全细胞脱氢酶活力提高了133.4%;菌体细胞量提高了12.8%。 (2)通过摇瓶静置发酵对O. oeni CECT4730发酵产酶的非营养条件进行了优化,确定的最适条件为:种龄36 h,接种量10%,温度30 oC,起始pH 4.9,装液量为200 ml/250 ml。以7 L发酵罐进行发酵放大试验,发现接种前充入CO_2形成厌氧环境更有利于该菌的生长和产酶,该菌对剪切力敏感,最适搅拌转速为50 r/min,与摇瓶静置发酵相比,发酵周期缩短了约4 h,全细胞脱氢酶活力(12.91 U vs 12.84 U)和菌体细胞量(OD_(600))(1.597 vs 1.574)均有一定程度的提高。 (3)运用原位分离技术构建了适合O. oeni CECT4730全细胞催化反应的新的Tis- HCl /正壬烷两相反应系统。通过对摇瓶反应中的限制性因素的考察,发现Va/Vo(v/v)、pH、温度、摇床转速、辅助底物及底物浓度等均能对反应产率和反应初速度产生明显影响,而只有pH和温度能对产物ee值产生影响。在最适反应条件下(V_a/V_o 1:1、pH 8.0、温度30 oC、摇床转速150 r/min、辅助底物葡萄糖和细胞用量比5.4:1(m/m)、细胞和底物的用量比0.51:1 (g/mmol)),当底物浓度达到0.94 mol/L时,反应24 h,时空产率的最大值比前期的研究提高了26.3%,达24 mmol/L·h,产物的ee (R) > 98%。 (4)从2 L发酵液中约11 g湿菌体开始目的酶的纯化,经超声波破碎细胞、硫酸铵盐析、Q-Sepharose-FF阴离子柱层析、Sephacryl S-200凝胶柱层析后,得到约0.36 mg电泳纯的(R)-ADH,活力为254.5 U/mg,酶活收率为2.4%,纯化倍数约25.6倍。纯酶的催化反应遵循反Prelog规则,还原2-辛酮得到的产物的ee (R)达到98.9%。 (5)该酶的主要酶学性质研究发现:其分子量为100 kDa (±10 kDa),亚基分子量49 kDa (±2 kDa),为双亚基结构。最适pH为8.0,最适温度为30 oC,均与全细胞催化反应的最适条件一致。Pb~(2+), Ag~+,和Hg~(2+)对其活力有较大的抑制作用;Fe~(3+), Cu~(2+)和Zn~(2+)次之。其底物选择性按2-己酮< 2-庚酮<苯乙酮< 2-辛酮的顺序表现为越来越适合该酶催化,而这些甲基酮取代基的大小依次为C_4H_9– < C_5H_(11)– < C_6H_5– < C_6H_(13)–。该酶为NADPH依赖型,对2-辛酮的K_m和V_m分别为0.2 mmol/L和67.1μmol min-1 mg-1,对NADPH的K_m和V_m分别为0.5 mmol/L和147.1μmol min~(-1) mg~(-1)。该酶在分子量、亚基结构、最适pH和最适温度、金属离子影响等酶学特性方面与文献报道过的(R)-ADH存在明显差异。……   
[关键词]:酒明串珠菌;不对称还原;(R)-2-辛醇;反Prelog规则;兼性厌氧菌;醇脱氢酶;分离纯化;酶学性质
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2010年