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犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其重组蛋白的抗原性研究

申卫红

  犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染犬或其它食肉目动物引起的高传染性、致死性疾病,以双相热、红疹、结膜炎、白细胞减少及中枢神经系统损害为主要特征,为危害特种养殖业发展的一类重要疾病。因该病没有特效药物进行治疗,所以对本病的预防和早期诊断就尤为重要。本研究主要包括以下三部分: 1犬瘟热N蛋白基因的克隆及序列分析 参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列,用oligo6.0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1 572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDV N重组质粒,并将其转入到大肠杆菌DH5α中,进行鉴定、测序。序列分析表明克隆的CDV N蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1 572个核苷酸,与GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列相比同源率达到93.9%-99.1%。 2犬瘟热N蛋白基因的原核表达及重组蛋白的反应原性研究将CDV N蛋白基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDV N重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。Western blot分析显示表达产物为84kDa的重组蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的反应原性。 3犬瘟热N蛋白基因原核表达条件的优化、重组蛋白纯化及免疫原性研究为了提高GST-CDV N重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性的表达量,对GST-CDV N重组蛋白在大肠杆菌中的多种表达条件进行了研究,选择最佳条件进行高效表达,用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-CDV N重组蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性重组蛋白。通过免疫小鼠证明了GST-CDV N重组蛋白具有良好的免疫原性。 本研究成功克隆、表达了犬瘟热N蛋白基因,纯化得到了具有很强抗原性的重组蛋白,为建立犬瘟热ELISA诊断试剂盒提供了可能,为亚单位疫苗的研制提供了依据。基础……   
[关键词]:犬瘟热病毒;N蛋白基因;克隆;原核表达;抗原性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆农业大学2010年