手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

豫产道地中药材金银花离体培养技术研究

刘文英

  金银花(Lonicera japonica Thunb.)是忍冬科忍冬属多年生木质藤本,其干燥花蕾和初开的花是临床上常用的药物,主要药用成分是绿原酸和异绿原酸,具有抑菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、解热、保肝、止血、降脂、抗生育、抗氧化、免疫调节等多种功效。主产于河南省封丘县的金银花是我国著名的道地中药材,但在生产中,其品种单一、退化严重且繁殖速度较慢,无法满足大田规模化种植和市场的需求。针对以上问题,我们首次对金银花中的优良品种“金丰一号”的离体培养进行了系统的研究。取得了如下研究成果: 1.建立了无菌培养技术体系。将金银花顶芽剥离成两叶一心后,在75 %酒精中灭菌30 s,再用0.1 %升汞处理15 min,然后无菌水冲洗5-6次,无菌苗得率达78.90 %,接种于MS+6-BA 1.0 mg·L~(-1) +NAA 0.2 mg·L~(-1)培养基上进行培养,30 d即可获得无菌试管苗。 2.建立了快繁技术体系。适于试管苗快繁的培养基是MS+6-BA 0.5 mg·L~(-1)+NAA 0.1 mg·L~(-1)+生物素-D 2 mg·L~(-1),繁殖周期为28 d,繁殖系数达到7.37;适于生根的培养基为1/2MS+IBA3 mg·L~(-1)+0.2 g·L~(-1)活性炭+15 g·L~(-1)蔗糖,配以合适的栽后管理,移栽成活率达100 %。 3.探讨了愈伤组织诱导与继代的最佳条件。最佳外植体是花蕾,其次是叶片,最佳培养基是MS+NAA 2 mg·L~(-1)+6-BA 0.01 mg·L~(-1)+2,4-D 0.5 mg·L~(-1),诱导率达100 %;适宜的继代培养基是MS+6-BA 2 mg·L~(-1)+KT 0.75 mg·L~(-1)+NAA 0.25 mg·L~(-1),在此继代培养基上,经过3-5次继代后可以得到四种不同类型的愈伤组织。 4.建立了细胞悬浮培养技术体系。选择黄白色、小颗粒、结构疏松、生长迅速的愈伤组织转入MS+6-BA 1.5 mg·L~(-1)+KT 0.75 mg·L~(-1)+NAA 0.5 mg·L~(-1)的液体培养基中,建立细胞悬浮培养体系。在该体系中细胞生长曲线呈“S”型,可分为延迟期(0~(-1)2 d)、指数生长期(12~(-1)8 d)和缓慢生长期(18-24 d)三个阶段,培养过程中细胞干重呈现上升趋势,并在18 d时达到最大,为8 g·L~(-1)。 5.研究了细胞悬浮培养过程中生理生化变化规律。(1)可溶性糖含量在培养过程中先下降后上升,3~(-1)8 d时,可溶性糖含量迅速上升,并于18 d时达到峰值;(2)可溶性蛋白质含量呈降升降趋势,0-6 d时缓慢下降,6-9 d时明显增长,9~(-1)5 d时相对含量变化不大,于12 d时可溶性蛋白质含量达到峰值,比细胞生长高峰提前6 d,之后呈下降趋势;(3)POD活性大致呈先升后降的趋势,0-6 d时先升后降,3 d时是一小高峰,6~(-1)2 d时伴随着细胞旺盛生长,开始迅速上升并在12 d时达到高峰,之后持续下降;(4)SOD活性呈先升后降的趋势,0-9 d时缓慢增长,9~(-1)2 d时迅速升高,12 d时达到峰值,之后呈持续下降趋势;(5)悬浮培养液的pH值先下降、后略微上升、再渐趋于平缓,维持在5.14-4.89之间;(6)悬浮培养液的电导率呈先缓慢上升后急剧下降再稍上升的趋势,0~(-1)2 d时,培养液的电导率一直呈极缓慢上升趋势,在12 d时升至最高点(0.53×104μs·cm~(-1)),随即呈下降趋势,与细胞生长呈现一定的相关性;(7)培养周期中绿原酸含量呈升降升降的趋势,0-6 d,绿原酸呈急剧上升趋势,在第6 d时升至最高点,随即呈下降趋势,15-21 d时再次呈上升趋势,直至在第21 d时达到另一峰值,只是比第一峰值(6 d时)低,21 d之后绿原酸含量又急剧下降。 6.初步研究了金银花染色体制片技术。以根尖为材料,用0.1 %的秋水仙素室温下避光预处理4 h,在1 mol·L~(-1)盐酸65℃恒温水浴中解离3 min,改良卡宝品红染液室温下染色4 h后,能取得良好的制片效果。 本文的研究结果,为进一步通过植物生物技术进行新品种的培育、良种的离体快繁以及有效药用成分的工厂化生产奠定了技术基础。……   
[关键词]:金银花;快繁;愈伤组织;细胞悬浮培养;生长曲线;生理生化变化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河南师范大学2010年