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两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用

吴异健

  近年来有部分中药多糖被临床应用于免疫抑制畜禽的免疫调节,但目前对传染病引起的畜禽免疫抑制和中药多糖免疫调节的机制尚未完全清楚。已有研究表明呼肠孤病毒(MDRV)感染引起雏番鸭免疫抑制。本研究通过建立番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病模型,进行了猴头菇多糖(HPS)和黄芪多糖()对MDRV感染导致免疫抑制雏番鸭的免疫调节试验,并分析HPS和APS对试验番鸭血清中部分细胞因子、神经递质和激素,以及脾脏组织IL-2和IL-6mRNA表达水平的影响,以探讨MDRV引起免疫抑制和HPS、APS免疫调节的机制。主要研究结果如下: 1.参照GenBank已发表的相关物种的肌动蛋白(β-actin)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)基因序列,设计合成三对特异性引物。从刀豆素(ConA)诱导的35日龄番鸭脾脏组织中,克隆了番鸭β-actin(Mdp-actin)、番鸭IL-2(MdIL-2)和番鸭IL-6(MdIL-6)的基因片段,并经测序验证。结果表明Mdp-actin、MdIL-2和MdIL-6的大小分别为786 bp、423 bp、322 bp,与引物设计时的目的片段大小一致。Mdβ-actin核酸序列与绿头鸭β-actin核酸序列(EF667345)的同源率为98.7%,与原鸡(L08165)的同源率为97.3%;MdIL-2核酸序列与番鸭IL-2核酸序列(AY193713)的同源率100%,与绿头鸭(AF294323)同源率为98.35%;MdIL-6核酸序列与绿头鸭IL-6核酸序列(AB191038)的同源性率99.7%。 2.应用MDRV-YB4分离株以2000TCID50的病毒量人工感染雏番鸭,3天后,人工感染雏番鸭与未接种MDRV健康试验番鸭以2:5的比例,将前者加入后者中进行同居感染,能引起后者典型番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病的发病过程、临床症状和剖检病变。为探讨HPS和APS对MDRV感染引起免疫抑制番鸭的免疫调节作用及其机制,以及进一步阐明MDRV引起感染雏番鸭免疫抑制机制建立了番鸭呼肠孤病毒病自然感染发病模型。 3.利用建立的呼肠孤病毒病自然感染发病模型,以不同浓度的HPS和APS分别经饮水给药方式对MDRV感染试验雏番鸭进行预防保护试验。结果显示HPS和APS分别以0.2g/L和0.6g/L浓度自由饮水口服均对MDRV感染试验雏番鸭有较好预防保护效果。 4.将2日龄试验番鸭随机分为人工感染MDRV组(AIG)、空白对照组(NCG)、同居感染对照组(CICG)、猴头菇多糖对照组(HCG)、猴头菇多糖预防组(HPG)、黄芪多糖对照组(ACG)和黄芪多糖预防组(APG),其中CICG、HPG、APG按建立的呼肠孤病毒病自然感染发病模型用AIG进行同居感染;随机分组后,HCG和HPG试验番鸭用HPS以0.2g/L浓度自由饮水,ACG和APG试验番鸭用APS以0.6g/L浓度自由饮水,对MDRV同居感染雏番鸭和MDRV人工感染发病番鸭进行防治的效果观察。结果表明:与CICG比较,HPG和APG试验番鸭发病死亡率分别为12%和4%,显著低于CICG死亡率24%,HPG和APG试验番鸭感染MDRV发病临床症状较缓和,剖检病变轻,尤为试验后期,APG试验番鸭剖检未见明显的MDRV感染病变。 5.采用放免检测方法(RIA)测定试验番鸭血清中白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、糖皮质激素(GC)、生长激素(GH)和p-内啡肽(p-EP)的含量,试验结果表明: (1)MDRV感染抑制试验番鸭机体分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、GH、ACTH,引起免疫应答即下降或停止;促进感染中后期试验番鸭机体分泌GC,导致免疫抑制;而试验番鸭血清p-EP水平波动较大,与其受应激的大小呈一定负相关联。 (2)猴头菇多糖(HPS)和黄芪多糖(APS)能促进试验番鸭机体分泌IL-1、IL-2和IL-4,维持血清IL-6、ACTH、β-EP含量相对稳定;有效调节MDRV感染番鸭GC水平,并维持在正常值范围;促进MDRV感染导致GH水平低下的番鸭机体产生GH,维持健康试验番鸭血清GH水平相对稳定。试验结果也显示APS免疫调节作用优于HPS。 6.采用荧光定量RT-PCR方法,以β-actin mRNA为内参基因,检测试验番鸭脾脏组织中IL-2mRNA和IL-6mRNA的相对表达水平,结果表明: (1)MDRV感染引起试验番鸭脾脏组织中IL-2 mRNA和IL-6 mRNA相对表达水平不同程度的下降,这与MDRV感染引起试验番鸭Th细胞的凋亡有关。 (2)猴头菇多糖(HPS)和黄芪多糖(APS)有助于MDRV感染番鸭脾脏IL-2mRNA和IL-6 mRNA稳定表达,可调节试验健康番鸭IL-6 mRNA水平相对稳定。 7.利用上述已扩增的MdIL-2基因开放阅读框(ORF) cDNA序列,经克隆筛选和测序后,构建出重组质粒pGEX6p-1/MdIL-2,转化大肠杆菌DH5α,并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,表达的MdIL-2。融合蛋白分子量约为40 kD。 研究结果揭示:①MDRV感染抑制雏番鸭神经-内分泌-免疫系统分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、GH、ACTH,促进GC分泌,导致免疫抑制。②APS和HPS通过能促进MDRV感染番鸭分泌IL-1、IL-2和IL-4,抑制细胞凋亡;维持血清IL-6、ACTH、β-EP含量相对稳定;抑制MDRV感染番鸭GC急剧升高,调节番鸭神经-内分泌-免疫系统达到稳定状态,促进MDRV免疫抑制番鸭康复。本研究结果可为HPS和APS对番鸭呼肠呼病毒病的防治提供理论依据。……   
[关键词]:黄芪多糖;猴头菇多糖;番鸭呼肠孤病毒;免疫抑制;免疫调节
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2010年