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猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗的构建及间接ELISA方法的建立

石运通

  目的:以构建的重组质粒pMD18-T-ORF2为基础,构建猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2, PCV2) FZ0502株ORF2 DNA核酸疫苗,并评价其免疫效果和安全性。 方法:应用构建的重组质粒pMD18-T-ORF2与真核表达载体PcDNA3.1在同等条件下进行双酶切,并通过T4连接酶进行连接,转化感受态细菌DH5a经37℃培养并挑取生长的菌落通过摇菌大量提取其质粒;应用BamH和xhoI双酶切技术,鉴定筛选阳性重组质粒;应用无内毒素提取质粒试剂盒提取阳性重组质粒,经过脂质体Lipofectamine 2000介导,转染单层的Vero细胞,37℃于C02培养箱维持培养4d后,提取Vero细胞总RNA,通过RT-PCR方法鉴定ORF2基因的表达情况;将阳性重组质粒腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠(100μg/只),同时设PBS和PcDNA3.1空载体为对照,间隔2周加强免疫1次。分别于首免后第14d和第28d采血,用ELISA方法检测血清抗体;取首免后第56d小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测该核酸疫苗的安全性。‘ 结果:pMD18-T-ORF2与真核载体PcDNA3.1经双酶切连接后转化感受态细菌DH5α并克隆,质粒用双酶切鉴定,结果显示582bp目的条带,阳性质粒命名为PcDNA3.1-ORF2。经过脂质体Lipofectamine 2000介导,转染单层的Vero细胞,提取Vero细胞总RNA, RT-PCR方法鉴定ORF2基因的表达情况,结果显示,在582bp位置出现了目的条带。间接ELISA方法检测免疫小鼠的PCV2抗体,核酸疫苗PcDNA3.1-ORF2诱导的PCV2抗体明显高于PBS和PcDNA3.1诱导的PCV2抗体;首免56d后,采集小鼠的器官经PCR方法扩增,均没有扩增出PCV2-ORF2的目的条带。 结论:成功地构建了PcDNA3.1-ORF2核酸疫苗,在体外Vero细胞中得到了瞬时表达,并且能诱导小鼠产生较强的免疫应答;安全性试验表明该核酸疫苗未整合到小鼠染色体上,是安全的。 目的:利用原核表达载体PGEX-6P-1表达弃掉信号肽的ORF2基因,将表达的PCV2-Cap蛋白包被酶标板,建立一种特异、快速、敏感的间接ELISA方法。 方法:培养含有重组质粒PGEX-6P-ORF2的大肠杆菌BL21,并用IPTG诱导表达,超声波破碎,提纯包涵体;通过稀释包涵体和二抗,用方阵滴定法确定抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度;将待检血清进行倍比稀释后,测定其OD490值,确定最佳血清稀释度;用建立的间接ELISA方法与韩国JBT的PCV2试剂盒共同检测20份阴性血清,以检测的平均OD490值加3倍标准方差作为阴阳性的临界值;用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒阳性血清,同时作PCV2阳性血清和阴性血清对照,验证间接ELISA特异性;检测三次16份PCV2阴阳性血清,每周检测1次,并通过方差分析比较结果的差异性;与韩国JBT的PCV2试剂盒同时分别对40份阴阳性血清检测,比较结果,并计算符合率;并对采集于福建省内的福州、宁德、厦门、莆田等地区的204份血清样品进行检测,评价检测结果。 结果:通过对间接ELISA方法反应条件的摸索,确定了该间接ELISA方法的最佳包被抗原浓度和兔抗猪IgG稀释度分别为1.5μg/孔和1:3000;最佳血清稀释度为1:400;阳性标准的临界值应大于0.427;对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、PCV2阳性血清和PCV2阴性血清进行测定,只有PCV2阳性血清出现阳性结果;重复试验结果显示,试验间差异不显著;与韩国JBT的PCV2试剂盒同时对阴性和阳性血清检测结果进行比较,阳性血清符合率为95%,阴性血清的符合率为90%,总符合率为92.5%;用建立的间接ELISA方法对采集福建省内猪场的204份血清检测结果表明,PCV2阳性率为76.5%。 结论:’建立的间接ELISA方法检测PCV2阳性血清具有特异性强,重复性和稳定性好的特点,可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。……   
[关键词]:猪圆环病毒Ⅱ型;PcDNA3.1;DNA疫苗;免疫效果;猪圆环病毒Ⅱ型;原核表达;间接ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2010年