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荧光共振能量转移体系的研究及其在均相免疫分析中的应用

胡珊

  荧光共振能量转移(FRET)是一种通过荧光物质之间发生非辐射能量转移进行分析的分子发射光谱分析法。FRET作为一种微小距离的“光学尺”,近年来在蛋白质、核酸结构功能检测、配体-受体相互作用测定等方面的研究工作发展迅速。关于FRET的研究工作主要集中在蛋白质、核酸结构及其相互作用的研究上,而在生物分析特别是免疫分析方面的研究相对较少。现阶段将FRET应用于免疫分析方面的研究在供受体之间连接臂、供受体偶联物的标记比以及供受体的配对等方面未有深入研究。本论文对多个FRET体系在均相竞争免疫分析中的应用进行深入研究,为基于FRET的均相免疫分析提供了新思路,主要研究结果如下: 1)首先,分别研究了二抗F(ab )2-QDs/小鼠IgG-RBITC、小鼠IgG-FITC/二抗-TRITC和小鼠IgG-FITC/二抗-Dylight 549三个FRET体系用于均相竞争免疫分析的可行性。实验结果表明,在连接臂的选择上,二抗F(ab )2-小鼠IgG和二抗-小鼠IgG这两种连接臂均满足FRET发生的条件,FRET现象明显。在供受体对的选择上,QDs与RBITC、FITC与TRITC是比较好的配对,FRET信号与竞争物浓度变化的关系较明显。通过以上研究工作,验证了FRET用于均相竞争免疫分析的可能性。 2)为缩短供受体之间的距离以提高FRET效率,以SA-biotin作为供受体连接臂,对SA-FITC/biotin-Dylight 549的FRET体系用于均相竞争免疫分析进行了研究。在研究中发现生物素对SA-FITC的荧光强度有增强作用,荧光增强约3-4倍,将其与FRET结合有利于提高分析方法的灵敏度。研究结果表明,FITC与Dylight 549是一对理想的FRET能量供受体,在FRET过程中能同时观测到供体和受体的荧光强度变化;与抗原-抗体连接臂相比,BAS连接臂能缩短供受体之间的距离,FRET过程更为明显。在此研究基础上,建立了基于荧光增强FRET的检测生物素的均相竞争分析方法,该方法操作简便,耗时短,反应时间只需15分钟;最低检测限可达0.5nM;线性范围宽(0.8-9.8nM),可用于实际样品(如牛奶)中生物素的检测。 3)研究了偶联物的F/P值(荧光染料和蛋白质的摩尔比)对FRET效率的影响。将稀土螯合物BHHCT-Eu~(3+)作为能量供体,Dylight 649作为为能量受体,羊抗小鼠IgG-小鼠IgG的免疫复合物为连接臂(BHHCT- Eu~(3+)标记羊抗小鼠IgG, Dylight 649标记小鼠IgG)研究F/P值对于FRET应用于免疫分析的影响。结果表明,只有当F/P值适中(F/P值在10左右)时才能得到高的FRET效率,F/P值过低使得供受体荧光团之间的平均距离变大导致FRET效率降低,而F/P值过高(大于20)会影响抗体与抗原结合的活性而致使FRET效率降低。 4)以稀土螯合物BHHCT-Eu~(3+)作为能量供体标记AFP抗原,Dylight 649作为能量受体标记AFP单抗,建立了一种基于时间分辨FRET的均相免疫分析检测甲胎蛋白的方法。该方法操作简便,耗时较短(反应时间约30分钟),且其线性范围较宽(0.05-2μg/mL),可用于AFP抗原的初筛。 本论文通过对多个FRET体系在均相竞争免疫分析中的应用进行深入研究,包括不同能量供受体对(传统有机染料、量子点、镧系元素)及不同连接臂的FRET体系(抗原抗体体系、生物素-链霉亲和素系统),探讨了FRET供受体对及供受体对的连接臂在选择上需要遵循的依据;研究了蛋白质的不同标记比对FRET效率的影响,为基于FRET的均相免疫分析提供了新思路。……   
[关键词]:荧光共振能量转移;均相免疫分析;能量供受体;连接臂;时间分辨荧光;量子点;甲胎蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中科技大学2010年