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用于海水有机磷农药监测的固定化乙酰胆碱酯酶制备与性质研究

张爱静

  有机磷农药(OPs)因其低残毒、易水解的特性逐渐取代了有机氯杀虫剂广泛用于农业生产,但农药的大量使用,导致其进入河流、湖泊、海洋等各种水体,对环境产生危害。近岸海域的有机磷农药污染不仅威胁到海水养殖业的可持续发展,最终也会通过食物链进入人体严重影响人类健康。近些年来,用于农药分析的现场快速检测方法迅速发展起来,其中以酶抑制法为基础的乙酰胆碱酯酶(AChE)传感器应用较为广泛。AChE的固定化是酶传感器制作的关键,它决定着酶传感器的稳定性、灵敏度、选择性和实际应用价值。但常用的载体材料性能不理想,因而不利于酶传感器的使用和推广 壳聚糖(Chitosan, CS)是由甲壳素脱乙酰基得到的线型高分子聚合物,分子结构中存在大量活性氨基和羟基,具有来源广泛、成本低廉、化学性质稳定、生物相容性好等优点,常被作为酶固定化的载体。将其制成壳聚糖微球(Chitosan microspheres, CS-MS),不仅可保留CS原有的性质,而且机械性能将明显提高,更适于流动注射系统中固定化酶的制备。 本研究以电鳗AChE为生物材料,采用乳液交联法制得CS-MS作为酶的载体,然后以戊二醛(GA)为交联剂,采用共价交联法进行AChE的固定,研究各种固定条件对酶活回收率的影响,确定适宜的固定条件:将1g CS-MS用5ml0.5%(v/v)的GA活化0.25h后,然后将其投入含0.75U的AChE、pH7.0-7.5的PBS中反应24h,此条件下制备的固定化AChE酶活回收率达81.94%,优于国内外同类研究结果。通过设计正交试验,以酶活回收率为评价指标,并综合考虑微球的物理性能,优化了CS-MS的制备条件,研究发现水油相体积比1:4、搅拌速度700r/mmin、分散时间1h、GA用量0.5ml、交联时间0.5h时,制备的微球机械性能和固定酶效果较好。 另外,红外光谱结果表明,AChE与载体结合过程中,微球上悬挂-CHO与酶-NH2之间通过共价反应生成Schiff碱,同时微球上C6-OH与酶-NH2还能够形成氢键。扫描电镜观察显示,CS-MS基本呈球形,具有错综复杂的空间网状结构,经GA活化的微球表面相对平整光滑,有利于酶的固定。 固定化AChE在海水体系中表现出良好的适应能力,固定化酶的适宜温度较溶液酶向高温方向移动,适宜pH范围未发生移动,抗盐能力略有提高。且固定化酶热稳定性和储存稳定性明显优于溶液酶,固定化酶在4℃磷酸盐缓冲溶液中保存60d后活力仅损失17%。同时固定化过程使酶分子的空间构象发生一定改变,产生了空间立体障碍或扩散阻力,米氏常数由8.157mmol/L提高到46.18mmol/L,降低了酶与底物的亲和力。 将本研究中制备的固定化AChE作为生物识别元件,对海水中OPs的监测研究进行初步探索。结果表明,农药浓度100μ/L,抑制温度30℃时,甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死蜱三种OPs对固定化AChE的最佳抑制时间为分别为30、20、20min,同时确定固定化酶对农药的响应规律,其对三种OPs的检测下限分别为5.34、5.75、5.95μg/L。因此,以固定化AChE最为敏感的甲基对硫磷作为参比农药,确定单位毒性当量为5.63μg/L,并采用毒性当量法评价海水样品中农药的综合污染水平。 综上所述,以壳聚糖微球为载体制备固定AChE,酶活回收率较高,机械性能良好,且其来源丰富,因而是一种很有潜力的AChE固定载体。固定化酶在海水体系中具有良好的酶学性能,对于有机磷农药具有响应快、灵敏度高等特点,并且毒性当量评价方法方便快速,由参比农药求出的毒性当量值更能反映农药的综合毒性及其污染的综合程度,在快速监测有机磷农药技术中展现出一定的应用前景。……   
[关键词]:壳聚糖微球;固定化酶;监测;有机磷农药
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年