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养殖鱼类病原菌检测芯片技术的建立

李永芹

   水产养殖鱼类细菌性疾病频繁爆发,危害极大,只有及时准确的诊断出病原才能进行有效的治疗,保证鱼类的健康养殖和可持续发展,因此,建立一种平行快速诊断方法至关重要。免疫芯片技术是一种新兴的免疫学检测技术,具有微量化、特异性强、敏感性高、样品处理简单、高通量平行分析等优点,在人类疾病的病原检测上已显示出广阔的应用前景,但在鱼类疾病病原检测方面的应用却鲜有报道。本文以琼脂糖修饰基片为载体,建立了两套微阵列芯片检测系统,包括检测鱼类病原菌的抗体微阵列和检测鱼类病原菌抗体的抗原微阵列。 选取海豚链球菌(Streptococcus iniae)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)及海分支杆菌(Mycobacterium marinum)等6种水产养殖鱼类病原菌,确认其致病性后,制备全菌兔抗血清;提取其中4种革兰氏阴性菌的外膜蛋白,切取特异性条带,制备特异蛋白条带的兔抗血清。采用ELISA、Western-blot及Dot-blot分析了6种病原菌与各兔抗血清之间的免疫反应,构建了检测6种病原菌的抗体微阵列,确定了芯片上抗体的最佳固定浓度、细菌孵育时间、标记抗体稀释倍数,对各株细菌进行了检测,并确定了其检测限。另外,优选各病原菌的特异性抗原,制备了检测病原菌抗体的抗原微阵列。本文还将所制备的抗体芯片与抗原芯片应用于人工感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)和天然患病红鳍东方纯(Takifugu rubripes)病原的诊断。具体实验结果如下: (1)通过致病性实验确认上述6株菌的半数致死量分别为7.94×105、6.31×105、1×106、7.94×105、1.26×107、2.51×107 cfu/尾,具有较强的毒力。 (2)提取迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌4种革兰氏阴性菌的外膜蛋白(OMP),切取35kD迟缓爱德华氏菌OMP、38kD鳗弧菌OMP、42kD杀鲑气单胞菌OMP、34kD和22kD荧光假单胞菌OMP,分别制备6种菌全菌及切取的OMP的兔抗血清,ELISA、Western-blot及Dot-blot分析6种鱼类病原菌与兔抗血清之间的免疫反应结果显示,34kD荧光假单胞菌OMP兔抗血清与各菌有强烈交叉反应,无法用于检测;其余各抗血清与相应的抗原菌株的反应是最强烈的,可用于免疫诊断芯片的制备与抗原菌的检测。 (3)将纯化的各兔抗血清的浓度稀释为3、2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL,每个浓度为一矩阵,每个矩阵内以3×3形式点样于芯片载体,结果显示,芯片上捕获抗体的最佳固定浓度为:海分支杆菌抗体为1.5 mg/mL,其余5株菌抗体为0.5mg/mL。将捕获抗体在片基上以4×4形式点样,细菌孵育时间设为0.5h、1 h、1.5h、2h、2.5h,结果显示,海豚链球菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌孵育1 h,而迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌和海分支杆菌孵育1.5 h时取得的信号值最高。检测抗体稀释倍数确定实验发现标记抗海豚链球菌血清可稀释2000倍使用,标记抗迟缓爱德华氏菌血清可稀释6000倍使用,而标记鳗弧菌、杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌、海分支杆菌抗血清可稀释4000倍使用。 (4)构建了检测6种病原菌的抗体芯片,第一种抗体芯片片基上固定的是各全菌抗血清,第二种抗体芯片片基上固定的抗体为海豚链球菌、海分支杆菌全菌抗血清及其余4种菌的OMP抗血清。利用抗体芯片对6种病原菌进行检测发现,使用酶标单一抗体对单株菌液进行检测,当捕获抗体为全菌抗血清时,可检测出1010-103cfu/mL的海豚链球菌、鳗弧菌,1010-104cfu/mL的迟缓爱德华氏菌,109-103cfu/mL的杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌、海分支杆菌;当捕获抗体为OMP抗血清时,可检出1010-103cfu/mL的海豚链球菌,1010-104fu/mL的迟缓爱德华氏菌,109-105fu/mL的鳗弧菌、荧光假单胞菌,109-103cfu/mL的杀鲑气单胞菌、海分支杆菌。单一检测抗体对混合菌液进行检测的结果显示,浓度为1010-106cfu/mL混合菌液内的海豚链球菌、海分支杆菌,109-105fu/mL混合菌液内的迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌,109-106cfu/mL的杀鲑气单胞菌,1010-107cfu/mL混合菌液内的荧光假单胞菌可被检出。酶标混合抗体对单株菌液的检测结果显示,1010-104cfu/mL的海豚链球菌、迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌,1010-103cfu/mL的鳗弧菌、荧光假单胞菌、海分支杆菌可被检出。 (5)分别提取了海豚链球菌的类M蛋白、荚膜多糖、胞外产物,4种革兰氏阴性菌的外膜蛋白、胞外产物、鞭毛蛋白和海分支杆菌的细胞壁蛋白,并制备6种菌的全菌破碎液,分别稀释为1 mg/mL,点在芯片载体上,根据是否与对应菌免疫牙鲆产生的抗血清反应筛选各菌的特异性抗原。用各菌特异性抗原构建抗原芯片,检测抗体水平变化结果发现,加强免疫后,检测点颜色逐渐加深,海豚链球菌免疫的牙鲆抗体在第四周时紫红色最深,说明抗体水平达到峰值,其他菌株免疫的牙鲆则在第五周时抗体水平达到峰值,之后缓慢下降。将6种菌的所有抗原点到同一矩阵内,构建病原菌抗原芯片,通过检测病原菌抗体以诊断病原,结果显示,检测注射无菌PBS的牙鲆抗血清时,除阳性对照点显深紫红色外,无其他任何反应;当检测样品为海豚链球菌免疫牙鲆后的抗血清时,抗血清可与该菌所有抗原点反应,而与其他菌的抗原点或无反应,或显色反应较浅,由此判定牙鲆已感染海豚链球菌;对其他5种菌免疫牙鲆后的抗血清进行检测的结果也是如此,说明构建的抗原芯片可以进行准确诊断。 (6)将构建的抗体芯片应用于人工感染一种或多种病原菌的牙鲆的病原诊断,结果显示,从单独注射海豚链球菌液或迟缓爱德华氏菌液的牙鲆组织里可准确检测出两种菌;注射鳗弧菌、荧光假单胞菌和海分支杆菌混合液的牙鲆组织匀浆液,在使用单一检测抗体时,可检出相应的病原菌,使用混合检测抗体时可同时准确检出3株菌;而抗体芯片对自然发病红鳍东方纯进行检测时发现在其胆汁中可检测到海豚链球菌、鳗弧菌、杀鲑气单胞菌与荧光假单胞菌。利用抗原芯片对人工感染后的牙鲆血清进行检测,发现芯片上海豚链球菌或迟缓爱德华氏菌的各抗原均被染色,判为海豚链球菌或迟缓爱德华氏菌检测阳性;对患病红鳍东方鲍及健康牙鲆血清的检测,除阳性对照外,未发现有其他点显色。ELISA对相同样品的检测得到了同样的结果。 病原菌检测免疫芯片是对传统免疫学检测手段的发展,本文构建了检测6种水产养殖鱼类细菌性病原的抗体芯片,及检测6种病原菌抗体的抗原芯片,实现了病原菌的准确检测,初步建立了养殖鱼类病原菌检测芯片技术,为免疫芯片技术在水产动物病原菌的高通量检测中的应用提供了方法依据。……   
[关键词]:病原菌;抗体芯片;抗原芯片;检测
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年