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大豆胰蛋白酶抑制剂的制备、理化性质和抗黄曲霉作用

张宾

  大豆乳清是工业上采用碱提、酸沉等工艺制备大豆分离蛋白的副产物。目前,我国每年排放的大豆乳清废弃液在300万吨以上,这既造成了大量的资源浪费又造成了环境的污染。而大豆乳清液中含有大量的功能性成分,如其中的胰蛋白酶抑制剂具有多种生理功能,在生物农药、医药等领域均有着广泛的应用前景。对于胰蛋白酶抑制剂的分离、纯化工作,目前仅在实验室水平上采取水浸、酸提、盐析、凝胶过滤层析等较为繁杂的方法纯化制得,耗时长、产率和纯度也不高;还有利用琼脂糖凝胶亲和纯化制得,但其材料价格昂贵且活化时具有较大毒性。 黄曲霉在自然界中分布很广,能侵染饲料、花生、油料等各种食物,而黄曲霉侵染后所产生的黄曲霉毒素是化合物中毒性最强的有害物质之一。目前,关于黄曲霉对食物浸染的控制研究还仅仅局限于采用通风、控制湿度和温度等物理方法,及添加有毒的化学抑菌剂等方法,而在花生、玉米及其他农产品中添加天然生物抑菌剂,以减弱黄曲霉侵染作用的研究还鲜有报道。。 本文利用壳聚糖、大豆及野生大豆为原料,将制备的壳聚糖树脂-胰蛋白酶亲和介质,应用于胰蛋白酶抑制剂的分离、纯化中,并研究胰蛋白酶抑制剂结构性质及其抗黄曲霉侵染活性,为开发控制花生、玉米等食品中黄曲霉毒素含量的生物制剂提供理论支持和应用基础。 1)壳聚糖树脂制备条件的优化:当壳聚糖溶液2.0%(w/v),搅拌速度300 r/min,戊二醛终浓度3.6%(v/v),还原剂NaBH4终浓度0.06 mol/l时,制备的壳聚糖树脂尺寸均一,球状规整,平均粒径约为416μm,适合于作为固定化酶的载体。经FTIR, XRD和DSC分析发现,交联反应主要是通过壳聚糖糖环上的氨基与戊二醛的醛基结合形成Shicff碱结构,连接分子间或分子内的壳聚糖分子进而形成球状的壳聚糖树脂。此外,戊二醛和NaBH4的添加量直接影响着制备树脂的孔度值、交联度及树脂表面的微观结构等。 2)壳聚糖树脂-胰蛋白酶制备条件的优化:以制备的壳聚糖树脂为载体,采用低毒、高效的环氧氯丙烷为活化剂,胰蛋白酶为偶联剂,制备了壳聚糖树脂-胰蛋白酶亲和介质。其最佳制备工艺条件为,环氧氯丙烷终浓度15%,活化温度60℃,偶联温度30℃,活化过程中加入适量的NaBH4和1,4-二氧六环。正是由于胰蛋白酶的固定化防止了蛋白肽链的折叠缠绕,保护了其三级结构或结构域不被过高的温度或环境所破坏,因此拥有较高的温度和pH耐受性,且具有良好的贮藏稳定性和操作稳定性。 3)胰蛋白酶抑制剂亲和纯化:采用盐析和等电点沉淀法从大豆及野生大豆乳清液中提取胰蛋白酶抑制剂粗品,然后以制备的壳聚糖树脂-胰蛋白酶为亲和介质进行一步亲和纯化,制得大豆胰蛋白酶抑制剂。纯化后的胰蛋白酶抑制剂经SDS-PAGE分析,呈现单一谱带,相当分子量为8.2 kDa,且亲和纯化倍数、比活力及活性回收率均较高。经其复合物分析、全水解氨基酸分析及氨基酸残基的化学修饰等方法证明,纯化制备的抑制剂属于Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂。 4)抗黄曲霉侵染活性:大豆及野生大豆胰蛋白酶抑制剂对黄曲霉生长具有较强的抑制活性,其IC50值分别为1.6μM和1.2州。当其浓度达到1.8μM时,可极大程度的抑制黄曲霉孢子萌发和菌丝体的生长。此外,通过黄曲霉分泌的α-淀粉酶和蛋白酶的活性及其对底物(淀粉、酪蛋白)的利用情况,发现抑制剂抑制黄曲霉生长的具体机理是通过抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性,进而限制黄曲霉分解碳水化合物所需营养物质的产生,阻断黄曲霉毒素的分泌和产生。 5)壳聚糖-胰蛋白酶抑制剂复合膜的制备及应用:以壳聚糖、胰蛋白酶抑制剂粗提取物为原料,甘油为增塑剂,即当壳聚糖浓度1.8%,抑制剂粗提取物浓度0.2%,甘油浓度1.2%,干燥温度45℃时,制备的复合膜具有较强抗黄曲霉活性。且复合膜表面及内部严紧致密,结构均一,分子间靠形成更多的氢键维持其稳定的结构。将该复合膜液涂膜于花生上,发现此复合膜对黄曲霉的侵染具有较强的抑制作用。 我国是世界花生的生产、消费和出口的主要国家,对于黄曲霉毒素污染问题目前仍无最佳防治技术。本研究在充分利用大豆乳清液资源和壳聚糖资源的基础上,采用制备的壳聚糖-胰蛋白酶亲和介质,纯化制备胰蛋白酶抑制剂,并将其粗提取物应用于花生的抗黄曲霉侵染中,为花生、玉米等谷物贮藏过程中的生物防治黄曲霉技术提供理论支持和具体应用基础。……   
[关键词]:大豆;胰蛋白酶抑制剂;亲和纯化;性质;黄曲霉;复合膜
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年