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哈维氏弧菌VHH溶血素对牙鲆组织细胞的侵染作用及诱导细胞凋亡作用研究

白方方

   哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性、发光的海洋细菌。近年来,哈维氏弧菌已成为海水养殖动物(鱼、虾)的重要致病菌,其引起的弧菌病给海水养殖业造成了巨大的经济损失。目前,哈维氏弧菌的致病机理还不完全清楚。对哈维氏弧菌进行深入研究,对于我国水产养殖业的健康发展具有重要意义。 本文首先研究了哈维氏弧菌对牙鲆各组织的侵染作用。用哈维氏弧菌VIB645感染牙鲆后,发病牙鲆的肾、脾、肝、鳃、脑和肠道等组织都发生明显的病理变化;用荧光免疫组化法对哈维氏弧菌在牙鲆中的分布进行了组织定位,发现牙鲆的肝、脾、肾和脑等组织中哈维氏弧菌呈阳性反应;通过扫描电镜技术研究了哈维氏弧菌对牙鲆红细胞的作用,结果表明哈维氏弧菌作用4h后牙鲆红细胞出现棘状突起,作用8h后出现起皱现象,作用12h时细胞裂解。 哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin,VHH)被认为是哈维氏弧菌对鱼类的重要致病因子,而活性位点突变的VHH溶血素(VHH突变蛋白)失去了溶血活力、磷脂酶活力和对鱼的致病性。本研究深入探讨了VHH溶血素对牙鲆红细胞和鳃细胞系FG-9307的作用。以VHH溶血素分别作用于牙鲆红细胞和鳃细胞,用台盼蓝染色法计算细胞存活率,发现牙鲆红细胞对VHH溶血素的敏感性远高于牙鲆鳃细胞。以VHH溶血素和VHH突变蛋白作用于牙鲆红细胞,电镜观察结果表明,经VHH溶血素作用后牙鲆红细胞表面首先发生棘皮化,随后细胞膜内陷,质膜破裂,最终细胞裂解,而VHH突变蛋白并不引起红细胞形态的明显变化。以VHH溶血素作用于牙鲆鳃细胞系,电镜观察结果表明牙鲆鳃细胞溶解严重,并形成凋亡小体;DAPI染色法进一步观察到受VHH溶血素侵染的牙鲆鳃细胞核体积变小,出现凋亡小体;细胞周期分析表明,VHH溶血素作用后的牙鲆鳃细胞的G]期比例及凋亡率增加;另外,VHH溶血素作用后牙鲆鳃细胞的原位末端缺口标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)的细胞阳性率增加,且半胱天冬氨酸酶-3(caspase-3)活力增加;这些结果表明,VHH溶血素通过caspases-3激活的细胞凋亡途径杀死牙鲆鳃细胞。通过免疫胶体金技术分析了VHH溶血素在牙鲆红细胞和鳃细胞中的分布,结果表明大量的VHH溶血素分布于细胞质膜及内膜系统上;而VHH突变蛋白在红细胞膜上也有少量分布。对腹腔注射VHH溶血素的牙鲆进行组织病理分析,结果表明受侵染的牙鲆肾、肝和肠道等有明显的组织病理变化,而VHH突变蛋白侵染的牙鲆无明显的组织病理变化;对VHH溶血素侵染的牙鲆各组织进行免疫组化分析显示,VHH溶血素主要分布在肠上皮细胞和鳃上皮细胞,说明肠道和鳃可能是哈维氏弧菌侵染牙鲆的重要部位。本研究深入探讨了哈维氏弧菌的致病机制,进一步阐明了TLH/VHH类溶血素的作用机理,对发展哈维氏弧菌的病害防治技术具有重要的指导意义。……   
[关键词]:哈维氏弧菌;组织病理;VHH溶血素;牙鲆;红细胞;鳃细胞系;超微结构;细胞凋亡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年