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玫瑰无须鲃卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子

张俊

  卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin, Lv),是卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)被卵母细胞吸收水解后的主要产物之一,是一种大分子糖脂蛋白。本论文以玫瑰无须鳃(Puntius conchonius)卵为材料,通过DEAE-23离子交换柱层析和Superdex 200凝胶过滤柱层析纯化得到了Lv,天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)显示Lv分子量约为370 kDa,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有三条带,分子量分别为125 kDa,110 kDa和76 kDa。糖、磷、脂特异性染色实验表明玫瑰无须鲃鱼Lv富含糖、脂,而磷含量较少。Lv的氨基酸组成析结果显示其与哲罗鱼,虹鳟鱼,以及青鳉鱼Lv的氨基酸组成十分相似,质谱分析结果表明从125 kDa和110kDa条带所得的肽段序列与鲤鱼卵黄蛋白原B1的Lv重链相匹配,而从76 kDa条带所得的肽段序列与鲤鱼卵黄蛋白原B1的Lv轻链相匹配。由氨基酸组成分析和质谱鉴定结果可以鉴定通过双步层析法纯化得到的蛋白确实为玫瑰无须鲃卵黄脂磷蛋白。用纯化的玫瑰无须鲃Lv免疫新西兰大白兔得到多克隆抗血清,用抗血清作蛋白免疫印迹(Western blotting)发现Lv具有明显的性别特异性,而且利用抗Lv血清可以检测雌性玫瑰无须鲃血浆中的Vg,利用免疫双扩散实验还发现Lv具有组织特异性。 Lv一直被认为是卵子发生和胚胎发育过程中的主要营养物质,但是其它方面的功能研究较少。鱼类发育成熟的卵细胞排到水中与精子结合形成受精卵,属于体外受精,胚胎和幼体发育都在水中进行,但是水中存在很多鱼类致病菌和病毒,这对于免疫系统还没有发育完善的胚胎和幼鱼来说是很大的威胁,本论文通过实验证明了Lv在胚胎和幼体发育阶段还发挥了抵御病原菌侵袭的作用,是一种具有调理素作用的免疫识别因子。将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Lv与大肠杆菌(E. coli)和葡萄球菌(S.aureus)孵育后荧光显微镜观察,发现E. coli和S. aureus均能发绿色荧光;卵匀浆液和Lv溶液分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌孵育,然后洗涤去除未结合的蛋白,最后用4M尿素洗脱结合在细菌表面的蛋白做Western blotting分析,结果在卵匀浆液和Lv溶液与两种细菌作用后的洗出液中,都能检测到Lv,上述两个实验证明Lv与大肠杆菌和葡萄球菌都能结合。为了更好的理解卵黄脂磷蛋白与细菌的结合机制,又做了酶联免疫吸附实验来调查细菌表面的哪些分子被卵黄脂磷蛋白所识别。实验结果显示,Lv能够识别非己成分,与病原相关模式分子(PAMPs),包括脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、肽聚糖(peptidoglycan, PGN)等发生特异性结合,并且结合呈现浓度依赖性。上述结果表明Lv是一种多价的模式识别受体。本论文还通过巨噬细胞吞噬细菌实验研究了Lv对巨噬细胞吞噬细菌作用的影响。通过定义两个参数来判断巨噬细胞的吞噬情况,一个为吞噬能力(phagocytic ability,PA),即吞噬了细菌的巨噬细胞个数占所有统计细胞总数的百分数;另一个为吞噬指数(phagocytic index,PI),即平均每个统计细胞吞噬细菌的个数。结果发现,与对照相比,经Lv处理的实验组的PA和PI都有显著性提高(p<0.05),说明Lv能够促进巨噬细胞吞噬细菌能力,可能具有类似调理素的功能。……   
[关键词]:卵黄蛋白;卵黄脂磷蛋白;模式识别因子;调理素;抑菌活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年