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脂多糖、多巴胺对凡纳滨对虾血细胞作用机制的研究

谢鹏

  本文研究了脂多糖、多巴胺对凡纳滨对虾血细胞吞噬作用和酚氧化酶原激活系统(proPO)的影响。主要探讨了(1)凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血细胞的体外免疫活性保存技术;(2)脂多糖、多巴胺对凡纳滨对虾血细胞吞噬作用机制的研究;(3)脂多糖、多巴胺对凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶原系统的影响;主要结果如下: 1.凡纳滨对虾血细胞体外免疫活性保存技术的研究 结果表明:4种保存液(CM、AC、MBHSS、M199)对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和酚氧化酶原级联系统胞吐影响显著(P<0.05),随着孵育时间的延长,4种保存液各处理组血细胞数量、存活率和丝氨酸蛋白酶原、酚氧化酶原活力逐渐下降,而酚氧化酶活力逐渐升高。在60min内CM处理组血细胞数量、存活率显著高于MBHSS和M199处理组,而CM与AC处理组在40min内无显著性差异,60min时CM处理组血细胞存活率明显高于AC处理组,而血细胞数量无显著差异;在0-20min内CM处理组丝氨酸蛋白酶原、酚氧化酶原活力均高于其它处理组,释放的酚氧化酶活力则低于其它处理组,而在40-60min内CM处理组与其它处理组各指标差异显著。同时在0-40min内CM处理组各指标无明显变化,60min时差异显著。由此可见,CM缓冲液可作为凡纳滨对虾血细胞体外免疫活性的保存液,而且体外实验应在40min内完成。 2.脂多糖、多巴胺对凡纳滨对虾血细胞吞噬作用机制的研究 结果表明:脂多糖LPS、多巴胺DA对凡纳滨对虾血细胞数量和吞噬率影响显著(P<0.05),LPS、DA与血细胞孵育30min后,高浓度(1-10 mg/L或μmol/L)处理组对虾血细胞数量均随作用浓度增大而明显下降,LPS处理组对虾血细胞吞噬率显著升高,而DA处理组对虾血细胞吞噬率则表现出明显的下降趋势。同时在LPS作用下,分别加入PKC、TPK抑制剂chelerythrine、genistein后,凡纳滨对虾血细胞吞噬功能受到明显的抑制作用,且抑制剂对吞噬的抑制效果为genistein> chelerythrine;在DA作用下,加入PKA抑制剂H-89后,血细胞吞噬作用得到增强,而chelerythrine、genistein两种抑制剂对吞噬无显著影响。 3.脂多糖、多巴胺对凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶原系统的影响 结果表明:LPS、DA对凡纳滨对虾总血细胞数量(THC),三类血细胞数量(DHC)和酚氧化酶原proPO系统影响显著(P<0.05)。LPS、DA与血细胞孵育30min后,高浓度(1-10 mg/L或μmol/L)处理组总血细胞数量,小颗粒细胞数量(SGC)以及大颗粒细胞(LGC)均显著下降,丝氨酸蛋白酶及血细胞酚氧化酶原活性明显降低,而胞吐酚氧化酶活性则显著升高。同时,在LPS、DA作用下,加入PKC抑制剂chelerythrine后,凡纳滨对虾血细胞丝氨酸蛋白酶原及血细胞酚氧化酶原活力均显著升高,胞吐酚氧化酶活力明显受到抑制,加入TPK抑制剂genistein后,胞吐酚氧化酶活力同样下降显著,而对丝氨酸蛋白酶原活力无影响,而加入PKA抑制剂H-89则对酚氧化酶原系统无显著影响。因此,凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶的激活可能受到PKC和TPK信号通路共同调节,而丝氨酸蛋白酶原的激活可能仅受PKC信号通路调节。另外,电泳结果显示,LPS,DA诱导凡纳滨对虾血细胞释放的酚氧化酶具有相同的分子量以及较高的双酚活性。PAGE电泳下,血细胞胞吐的酚氧化酶蛋白分子量分别为526kDa和272 kDa,而血细胞溶解产物仅得到一条蛋白条带为272 kDa。非还原SDS-PAGE电泳下,血细胞胞吐酚氧化酶蛋白分子量分别为166 kDa和126 kDa。将PAGE电泳中的两条蛋白条带526 kDa和272 kDa回收,在还原SDS-PAGE电泳下均得到78.1 kDa和73.6 kDa两条蛋白带。由此说明,凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶为多聚体结构,可能由相同的单体构成,且在血细胞内、外具有不同的结构形式。……   
[关键词]:脂多糖;多巴胺;凡纳滨对虾;吞噬;酚氧化酶原系统;信号通路
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年