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单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究

杨瑞梅

  狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种动物源性人兽共患传染病,病死率极高,在世界范围内广泛流行,我国是狂犬病流行最严重的国家之一。人被带狂犬病毒的犬咬伤后,控制的基本策略是暴露后治疗(Post exposure treatment, PET),高危暴露(Ⅲ级)时,WHO推荐使用抗狂犬病免疫球蛋白作为被动免疫制剂。动物源免疫球蛋白可能导致轻重不等的过敏反应,而人抗狂犬病免疫球蛋白又有传播血液疾病的危险。因此,寻找有效和特异的治疗狂犬病的新方法显得十分重要。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是内源性或外源性双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)诱导的mRNA水平的基因表达沉默现象,将21-23nt的干扰性双链小RNA (short interfering RNA, siRNA)导入目的细胞,可以诱导高效且特异的RNAi效应。目前,RNAi已经成为替代基因敲除技术进行基因功能研究的有力工具。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入,在癌症和一些病毒性疾病如艾滋病、乙型肝炎等,用siRNA治疗研究已进入一期或二期临床试验,有望成为新型的治疗制剂。 RNA干扰可由人工合成双股siRNA或者将表达shRNA (small hairpin RNA, shRNA)的载体转入细胞中,在Dicer酶作用下,shRNA被加工成siRNA。由于体外合成的siRNA导入机体后易被降解,而shRNA良好的重复性和较长的细胞内效应期,价格经济,也是以siRNA进行基因治疗的首选方式。所以本研究选择以质粒载体表达shRNA进行靶向药物效果评价。 治疗性小干扰RNA面临最大的问题是在体内安全运送而不被RNA酶、内质网的滞留作用、肾脏代谢等复杂的体内降解消耗机制作用而减少或消失,目前解决这个难题的有效方法之一是将siRNA用能识别感染细胞表面特异受体的蛋白与siRNA作用,将siRNA包裹起来,既保护了siRNA又使其实现靶向运送。体内细胞类型特异性的基因沉默可以通过siRNA与细胞类型特异性亲和配体或单克隆抗体结合而实现。即抗体指导的siRNA复合物通过内吞作用进入靶细胞,随后释放到细胞浆,通过RNA干扰路径,特异性地沉默靶基因的表达。抗体成份与小核酸分子结合后能在体内实现有效运送siRNA。已在体内证明了这种运送方式不使机体产生特异免疫反应和毒性,成为有前景的治疗性方法。 本研究以针对人源狂犬病毒G糖蛋白二硫键稳定单链抗体(single chain disulfide-stabilized antibody, scdsFv)来特异识别感染细胞表面出芽的狂犬病毒,用绿脓杆菌外毒素跨膜区ETA部分实现穿膜,以酵母DNA结合结构域GAL4与含有特异shRNA的质粒结合,制备了狂犬病毒靶向药物,并对该药物在体内外抑制RV的复制情况进行了探索,以期为狂犬病暴露后乃至发病后的治疗积累必要的实验数据。 本研究针对狂犬病毒N蛋白编码基因,设计合成了4对shRNA,以随机序列shRNA为阴性对照,将shRNA分别连接到表达载体pRNATU6.3上,转染BHK-21细胞后,在潮霉素抗性压力下,筛选获得稳定表达shRNA的BHK-21细胞株。在体外检测其对狂犬病毒标准攻击毒CVS-11的抑制效果,用直接免疫荧光、荧光定量PCR、Western blot检测表明,筛选出具有高效抑制RV复制的2个靶位点N-489和N-701。 为获得能良好识别RV感染细胞的单链抗体,根据已发表的具有广谱中和效力的人源RVG单抗序列,设计点突变位点,人工合成scdsFv序列,连接到pET-22b (+)载体上,经大肠杆菌表达,获得包涵体表达的scdsFv蛋白。亲和力、特异性和中和能力检测表明该scdsFv具有特异识别狂犬病毒感染细胞的能力。 为了制备能与含shRNA的质粒载体结合的具有导向作用的嵌合蛋白,设计引物从质粒PE40-GAL4-T上扩增获得了绿脓杆菌外毒素穿细胞膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,将ETA-GAL4、scdsFv通过搭桥PCR,获得了scdsFv-ETA-GAL4基因,即SEG,在原核表达载体pET28a中表达了融合蛋白SEG。此蛋白以包涵体表达为主,经包涵体变性、Ni-柱纯化、复性后获得有活性SEG蛋白,实验表明此融合蛋白明显保留有抗原结合活性,可特异结合细胞膜上的病毒抗原。 SEG可以结合并转运shRNA到狂犬病毒感染细胞。凝胶阻滞实验检测表明,SEG蛋白具有与shRNA结合的能力,且这种结合存在着剂量依赖关系:1nM SEG可以结合约10nM shRNA;绿色荧光蛋白(GFP)显示SEG蛋白可将含shRNA的质粒特异性运送到病毒感染的细胞。MTT检测表明SEG-shRNA复合物对细胞生长没有毒性作用。在感染细胞中,病毒RNA水平和蛋白水平检测结果均表明,SEG靶向转运shRNA能够有效地抑制病毒的复制。 在小鼠后肢肌肉注射CVS-24毒以制备动物模型。在小鼠感染模型中,取50LD50 RV标准攻击毒CVS-24攻毒后,尾静脉注射SEG-shRNA复合物,进行狂犬病毒的体内靶向效应试验。结果显示,靶向药物SEG-shRNA注射后30h,流式细胞仪检测表明仅在注射病毒的右侧后腿肌肉检测到GFP,其余组织和内脏器官均无GFP表达。表明此复合物在体内可实现靶向性运送。小鼠保护性试验表明,注射病毒后8h尾静脉注射SEG-shRNA,5d后检测小鼠脑内RV含量:RT-PCR、Western blot检测表明使用靶向药物组RV含量明显少于病毒对照组,条带亮度变弱;qRT-PCR表明靶向药物组比病毒对照减少4.88倍;小鼠发病时间比病毒对照组晚48h,用SEG-shRNA组动物存活率达50%,而病毒对照100%死亡。检测小鼠体内IFN-a未见升高,与正常组差异不明显,证明在动物体内产生的保护作用是由针对病毒RNA的特异shRNA所介导。结果表明SEG-shRNA对小鼠有明显保护作用。总之,试验结果显示,SEG蛋白可以特异性转运含shRNA质粒进入细胞,并沉默靶基因的表达,因此可以用于狂犬病毒感染的特异辅助性救治研究。……   
[关键词]:狂犬病;靶向治疗;shRNA;单链抗体;基因运送
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2010年