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猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原表位及组织定位的研究

郭爱疆

  囊尾蚴病是由猪带绦虫的幼虫——囊尾蚴寄生于人或猪而引起的人畜共患寄生虫病,该病不仅给畜牧业造成一定的经济损失,而且还威胁着人类健康,是经济落后国家和地区重要的公共卫生问题。TSOL18是猪带绦虫六钩蚴阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴入侵中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外能有效杀死六钩蚴,体外表达的重组TSOL18能完全保护猪不被猪带绦虫虫卵感染。随着免疫学的发展,人们认识到有效的保护是抗原表位的参与。因此,阐明猪带绦虫TSOL18蛋白的抗原表位和组织分布对于该病的新型诊断试剂以及分子疫苗设计方面意义重大。 本研究挑取实验室保存的重组菌株Pichia pastoris pPIC9K-TSOL18进行5L发酵罐发酵培养,甲醇诱导72 h后将表达上清液进行SDS-PAGE,用薄层扫描分析,目的蛋白约占上清总蛋白含量的80%以上,目的蛋白表达量达2.00g/L。重组蛋白TSOL18经Sephadex G-100分子筛凝胶层析纯化后,其纯度达90%,满足制备单抗的抗原要求。 将纯化的TSOL18作为免疫原,制备了12株可分泌TSOL18单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经分型试纸条鉴定,12株单抗分属于IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM抗体亚型,轻链均为K型;ELISA叠加试验表明,12株单抗分别识别2个不同抗原表位,2株不同抗原表位单克隆抗体的腹水效价分别达1×102和1×106;杂交瘤细胞株的染色体组型、单抗的稳定性等的分析表明,所获得的12株单抗均能稳定分泌,满足常规实验的要求。 采用次氯酸钠溶液、胆汁和胰酶获得激活的六钩蚴,虫卵的脱壳率为95%,六钩蚴的活力为72%,然后用TSOL18免疫的猪血清和TSOL18单抗对激活的六钩蚴分别进行体外杀伤实验,台盼蓝染色判定六钩蚴活力。结果证实在有补体的情况下,多抗和单抗6天时对六钩蚴的杀伤率分别为73%和52%。 为了分析单抗的抗原结合位点,本研究利用TSOL18单克隆抗体筛选噬菌体随机12肽库,通过四轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选,对噬菌体12肽库进行了富集。随机挑取的59个噬斑提取DNA后测序,根据测序结果推导出的TSOL18单抗识别的表位氨基酸序列分别为ETTKLQRFQAML (L1)和DHTLF (L2),两个序列出现频率分别是83%和15%。ELISA方法检测噬菌体克隆与单抗MAb或BSA的结合反应表明,两个表位均与单抗特异性结合。在验证噬菌体蛋白抑制实验中,加入不同滴度的纯化噬菌体Ll或L2克隆,以阻断TSOL18 MAb与TSOL18抗原的结合,结果显示,随着噬菌体滴度的降低,对TSOL18 MAb与TSOL18抗原结合的抑制率也逐渐降低,呈剂量效应关系。 将筛选出的特异性噬菌体克隆大量扩增,纯化蛋白免疫小鼠,检测血清与TSOL18蛋白的反应性。ELISA结果显示,筛选的两个表位均能与TSOL18抗原发生反应。同时用两个表位作抗原检测表位与TSOL18免疫的猪血清的反应性。ELISA结果显示,两个表位均与被检血清反应。用筛选到的表位检测猪囊尾蚴病血清,ELISA敏感性分别为85%(L1)和79%(L2)。利用噬菌体展示技术筛选TSOL18抗原表位为猪囊尾蚴病免疫和诊断技术的进一步研究奠定了基础。 采用胶体金标记技术对猪带绦虫六钩蚴宿主保护性抗原TSOL18进行定位,发现金颗粒沉积于小钩、穿刺腺细胞的细胞质和分泌颗粒周围,而对照血清的六钩蚴胶体金染色未见特异性金颗粒沉积。……   
[关键词]:猪带绦虫;六钩蚴;TSOL18;单克隆抗体;噬菌体展示技术;抗原表位;抗原定位
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2010年