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禽流感H5亚型、结核分支杆菌及弓形虫感染金标快速检测技术研究

李克生

  目前,由各种病原微生物引起的感染性疾病仍然是危害人类健康、导致人类和动物死亡的重要原因。其中禽流感、结核等病原体引起的感染性疾病呈爆发流行,引发重大的社会和经济问题。弓形虫病等人兽共患病在严重威胁畜牧业发展的同时,也可引起人口出生健康等问题。研究病原微生物的新型检测技术及试剂盒产品,对感染性疾病的防控具有重要意义。本论文采用单克隆抗体技术、基因工程技术、胶体金标记及免疫层析技术,建立了禽流感H5亚型病毒(AIV-H5)、结核及弓形虫感染金标快速检测技术并研制了试剂盒。 用AIV-H5抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选AIV-H5单克隆抗体(McAb),测定抗体亚类并分析其抗原结合位点。结果共获得5株单克隆抗体,均具有良好的型特异性。除了一株抗体亚类为IgM外,其余4株均为IgG,腹水抗体效价最高可达1:2.56×10~5,其中三株单抗具有不同的抗原结合位点,适合“双抗体夹心”免疫反应。用一株胶体金标记的AIV-H5 McAb和另一株未标记AIV-H5 McAb包被硝酸纤维素膜,制备金标检测试剂盒。结果与AIV-H5抗原反应较好,与AIV其它亚型及NDV,IBV,EDSV等禽类病毒不发生交叉反应。检测灵敏度可达到1:2~2血凝( HA)效价单位,比琼脂扩散试验高10倍,但比荧光免疫组化法低10倍。检测试剂盒的符合率、重复性均达到100%,紧密型性CV值为0,37℃12d破坏实验表明试剂盒质量稳定。除心脏检测为阴性外,试剂盒对人工感染鸡的肝、脾、肺等脏器的检测结果与鸡胚病毒分离培养100%符合。田间试验结果与荧光RT-PCR试剂盒符合率为100%。 根据结核分枝杆菌TB16和TB38基因序列设计引物,以结核分枝杆菌(H37Rv)基因组DNA为模板进行PCR扩增,分别克隆TB16和TB38基因片段。用限制性内切酶酶切后分别与pET-30a质粒连接再转入E. coli DH5α感受态细胞,挑取转化菌落提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。将构建的重组表达质粒pET30a-TB16和pET30a-TB38转化E. coli BL21(DE3),诱导表达后用SDS-PAGE进行分析。结果PCR扩增分别获得约0.4 kb的TB16基因片段和约1.1 kb的TB38基因片段。成功构建了pET30a-TB16和pET30a-TB38重组表达质粒,测序结果表明插入的TB16和TB38目的基因片段分别为435 bp和1053 bp,与GenBank中的相关基因序列完全相同。pET30a-TB16转化菌经IPTG诱导后,在相对分子量21 kDa处有表达带出现,重组蛋白主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%左右。pET30a-TB38转化菌经IPTG诱导后,在相对分子量41 kD处有表达带出现,重组蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右。应用TB16和TB38重组蛋白作检测抗原包被硝酸纤维素膜,研制了结核抗体金标阵列检测试剂盒。结果对结核抗体阴阳性质控品检测符合率均达到100%,紧密性CV值为0,37℃12d破坏实验表明试剂盒质量稳定。检测活动性肺结核病人血清抗体的灵敏度为78.3%,特异性为93%,其敏感性明显高于抗酸染色(27.96%)和细菌培养(57.99%),差异极显著(P﹤0.01),比单用TB38重组蛋白为检测抗原的结核抗体金标检测卡(72.2%)高6.1%。检测抗酸染色阴性病例,结核抗体阳性率达到77.66%,检出率接近阳性病例(82.32%)。检测结核分枝杆菌培养阴性病例,结核抗体阳性率亦可达到65.5%,但检出率不如阳性病例(85.82%)。 应用弓形虫分泌抗原制备了“双抗原夹心”弓形虫抗体金标检测卡。结果对弓形虫抗体阴阳性质控品检测符合率均达到100%,紧密性CV值为3%,37℃12d破坏试验和常温保存18个月,检测卡质量保持不变。对852份健康体检人血清、547份孕、产妇血清以及1206份各种肿瘤病人血清样品检测的阳性率分别为2.87%,4.38%和6.72%,与ELISA符合率达96%。弓形虫在肿瘤患者中的感染情况显示,肿瘤患者弓形虫阳性率高于正常体检人群2.38倍(肿瘤患者6.72%,正常体检人2.82%),两者相比差异显著(P<0.01)。不同临床类型恶性肿瘤患者弓形虫感染率不同,以肾癌患者最高(22.50%),其次为肺癌(15.04%)、皮肤癌(12.05%)和乳腺癌(9.03%)患者,高于正常人的感染率(2.82%)3-8倍,差异极显著(P<0.01);消化道癌患者感染率(5.56%)与正常人相比差异显著(P<0.05);子宫癌(3.70%)和其他恶性肿瘤(3.68%)感染率略高于正常人,但无显著性差异(P﹥0.05),而血液淋巴系统恶性肿瘤(2.27%)、肝癌(1.79%)和甲状腺癌(0)感染率低于正常人。不同临床类型肿瘤患者之间弓形虫感染率差异较大,最高感染者肾癌是其他恶性肿瘤患者平均感染率(6.72%)的3.3倍,两者之间有极显著差异性(P<0.01)。 本研究研制的AIV-H5金标检测试剂盒、结核抗体金标阵列检测试剂盒及弓形虫抗体金标检测卡特异性强、敏感性高,可适用于H5亚型禽流感、结核病及弓形虫病的检测、监控和临床诊断,是具有广泛应用价值的快速检测试剂。……   
[关键词]:禽流感H5病毒;结核病;弓形虫感染;金标快速检测试剂盒
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2009年