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GnRH-A免疫对家兔生殖功能的调节作用及机理研究

魏锁成

  促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)为动物生殖过程中最重要的激素之一,GnRH的结构为9种不同氨基酸残基组成的10肽,它和脑垂体促性腺激素分泌细胞的特异性受体结合后刺激促性腺激素的产生和释放,但天然的GnRH计为量,多用其类似物(GnRH-A)替代。GnRH-A通过改变GnRH的结构使其与GnRH受体亲和力增强。然而,对GnRH-A的应用效果缺乏系统的定量研究,尤其其作用机理依然不清,看法不同。本研究的目的就在于系统深入的探讨促性腺激素释放激素类似物(GnRH-A)对动物生殖免疫的调节作用和机理,通过GnRH-A对雄兔免疫去势和雌兔生殖免疫调节的系列实验研究,为动物临床和生产实际科学运用提供依据。 (1)以EDC.HCL为偶合剂,将GnRH-A阿拉瑞林(Alarelin)与BSA连接为复合物,再加入弗氏不完全佐剂制成抗原乳剂。(2)将16只3月龄健康日本大耳白兔雄兔随机均分为3个实验组兔(分别注射50μg/ml、100μg/ml和150μg/ml Alarelin抗原各1.0 ml)和对照组,于0、7、14、21、28、35、42 d采血分离血清,用间接ELISA法测定GnRH抗体效价。(3)30只3月龄健康日本大耳白兔雄兔,随机分为三组, EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和对照组(CG); EG-Ⅰ与EG-Ⅱ颈背部皮下注射1.0 ml(100μg/ml)Alarelin抗原, EG-Ⅱ于20 d加强免疫一次,空白对照组不做任何处理。0、7、28、49、70、91、102 d采血5 ml分离血清,用ELISA测定血清GnRH抗体效价与睾酮含量;在第0、30、60、90和110 d分别称重,于实验第110 d摘取两侧睾丸,除去附睾及周围脂肪,用游标卡尺测量其长度并称重。以全自动血液分析仪检测15项血液细胞参数,i-STAT便携式血气分析仪分析10项血气指标。(4)用实时荧光定量PCR分析垂体中GnRHR、FSHβ和LHβmRNA的表达。( 5)应用DNAMAN、Tmpred、SignalP 3.0、TargetP 1.1、Expasy、PSORTⅡprediction等生物信息学分析软件和在线工具,对GnRHR序列和蛋白的理化特性、跨膜结构、信号肽、细胞定位、二级和三级结构特征等进行分析和预测。(6)24只3月龄日本大耳白兔雌兔分为4组,EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ颈背侧分别注射1.0mL(100μg/mL、100μg/mL和50μg/mL)GnRH-A抗原,EG-Ⅱ和EG-Ⅲ于20 d加强注射一次,ELISA法测定血清GnRH抗体效价、促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)含量。70 d采集卵巢和子宫,进行光学和电镜观察、拍照。(7)用免疫组织化学SP法及图像分析技术进行定位与分析。 (1)制备的GnRH-A抗原为乳白色均匀悬液,物理化学性状稳定良好,安全可靠,无任何不良反应.(2)以50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml免疫接种后,各组动物均在14 d检测到GnRH-A抗体,第4周左右达到高峰, ELISA效价分别为1:800、1:1600和1:1600,说明100μg/ml、150μg/ml剂量的抗原产生的抗体效价相同,故实践可用100μg/ml的剂量。(3)在免疫注射的30只兔中,EG-Ⅰ和EG-Ⅱ血清GnRH抗体水平在免疫注射后一直高于对照组,并分别在第28 d和49 d的达到高峰,但EG-Ⅰ抗体水平从28 d的1600急剧下降到49 d的800,抗体水平的高峰期持续时间很短,下降很快;而EG-Ⅱ抗体水平在70 d时仍与EG-Ⅰ相同,为1600,EG-Ⅱ的抗体水平也明显高于EG-Ⅰ,在免疫后28、49、70、91 d两实验组与对照组的有差异;102 d时,EG-Ⅱ血清睾酮浓度与对照组差异极显著(P<0.01);EG-Ⅰ与EG-Ⅱ在49 d血清睾酮水平差异显著(P<0.05);EG-Ⅱ睾丸平均长度与EG-Ⅰ差异极显著(P<0.01);EG-Ⅱ雄兔的体重和平均日增重均最大,而且显著高于EG-Ⅰ和对照组。(4)15项血液细胞指标到实验末与对照组正常值无显著差异(P>0.05),免疫后7~110d,实验组WBC、MCV、PLT和LYM轻度升高,其余指标正常;28d时仅TCO2HCO3-显著升高(P<0.05),10项血气指标值均在正常范围内。注射GnRH-A后,EG-Ⅱ的Cu含量无明显变化,28d时Zn含量显著低于注射前(P<0.05),;Fe含量呈轻度下降趋势,但与注射前无显著差异。(5)雄兔GnRHR的核苷酸为1179bp,同源性达96%,核苷酸中含A 338(28.7%),C 293(24.9%),G 224(19.0%),T 324(27.5%)。ssDNA分子量为362.66 kDa,dsDNA 726.78kDa。GnRHR二级结构有151(40.27%)个氨基酸组成α-螺旋,15(4.00%)个氨基酸组成β-折叠。GnRHR理论等电点(pI)5.02;不稳定指数58.08,脂肪指数28.67,疏水性平均值(GRAVY) 0.869,表明该蛋白为不稳定的疏水性蛋白,没有潜在糖基化位点。GnRHR蛋白TM螺旋长度为17~23,有34个强跨膜螺旋区,从内到外有35个螺旋,从外到内有37个螺旋,得出了GnRHR的质粒模板图。GnRHR信号肽的概率0.999,最可能的酶切部位在17和18位点。(6)雌兔注射GnRH-A后10d均出现GnRH抗体,对照组未检测到;EG-Ⅰ在第30d达到高峰, EG-Ⅱ和EG-Ⅲ于40d~50d至峰值,但在实验结束时(70d)实验组均高于对照组(P<0.05),40d~70d时EG-Ⅱ显著高于EG-Ⅰ和EG-Ⅲ(P<0.01)。30d~50d时EG-Ⅱ的LH明显高于EG-Ⅰ和EG-Ⅲ及对照组。EG-Ⅱ和EG-Ⅲ的FSH浓度在40d达到峰值,但EG-Ⅱ高于EG-Ⅰ、对照组(P<0.01)及EG-Ⅲ(P<0.05),EG-Ⅰ和对照组无显著差异。(7)GnRH-A能够增加卵巢初级卵泡数量,增大卵泡的纵径和横径(P<0.05),促进卵巢和卵泡发育与成熟,且与剂量相关;重复注射似乎不会加速卵巢和卵泡发育。GnRH-A能使细胞核和线粒体变大,细胞质内皮质颗粒、分泌物线和粒体嵴的数量增加,透明带和绒毛增宽增长,从而明显的加快卵母细胞的生长。(8)卵巢和子宫均有GnRHR和GnRH阳性细胞分布,阳性细胞主要见于卵母细胞、卵泡细胞、子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞,GnRHR的注射剂量不同GnRH和GnRH阳性细胞的染色强度也不同,染色强度越大,相应受体的表达水平就越高,但是两者分布和定位的数量并非完全一致,GnHR-A对在GnRHR和GnRH卵巢与子宫中的分布具有影响,EG-2的作用更为明显。 (1)GnRH-A(阿拉瑞林,Alarelin)抗原具有良好的免疫原性,为了延续抗体的高峰水平,有必要加强免疫。 (2)GnRH-A主动免疫对家兔的睾丸发育、血清睾酮和性行为具有明显的影响,加强免疫效果更理想。用GnRH-A主动免疫时对雄兔血液细胞成分、血气指标和血清微量元素Fe、Zn和Cu均无显著影响。 (3)兔体内注射GnRH-A可以明显提高GnRH抗体效价,增强LH和FSH的合成与分泌,加强注射效果更明显,且与注射剂量相关,持续时间为40d左右。GnRH-A能促进雌兔卵巢和卵泡发育与成熟,对卵巢和子宫的显微和超微结构具有明显的作用。 (4)阿拉瑞林免疫可以降低垂体GnRHR、FSHβ和LHβ基因表达,GnRHR是一种含有信号肽序列的不稳定的疏水性跨膜蛋白,具有明显的生物信息学特征。 (5)卵巢和子宫都有GnRHR和GnRH阳性细胞分布,GnRH-A主动免疫对在卵巢与子宫中GnRHR和GnRH的分布具有增强作用。……