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鸡血清IgG的纯化及其单抗制备与鉴定

王骏俊

   IgG是血清中主要的免疫球蛋白(Ig),占血清Ig总量的75%~80%,它是血液中主要的抗体成分,血清中IgG水平的测定,已是疫苗免疫效果评定和体液免疫研究的常用指标。与常规免疫血清相比,单克隆抗体具有与抗原结合的高特异性,是免疫学和血清学研究的重要工具,在畜牧兽医的疾病诊断与治疗方面已经被广泛应用。在养禽业中,运用这些单克隆抗体来检测疫病特异性的抗体,对全面、系统地了解禽的机体对病原体感染的免疫应答反应并采取相应的防制措施有重要意义。此外,为研制有效试剂盒,检测禽病及疫苗免疫水平奠定基础。 本文主要围绕鸡免疫球蛋白的提纯及其单抗制备与鉴定,做了如下工作: 首先,采用饱和硫酸铵盐析粗提鸡血清Ig,然后再用葡聚糖G200凝胶层析分离纯化IgG。经SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度鉴定,表明纯化后的IgG达到了一定纯度。同时,用Folin-酚法进行浓度测定,IgG蛋白浓度达到2.4mg/mL。 其次,用纯化后的鸡IgG按常规方法免疫6~8周Balb/c雌性小鼠,无菌取三次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,连续进行两次亚克隆,共获得了四株分泌抗鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为C44、C45、C67、C68。经过五次亚克隆,四株单克隆杂交瘤细胞能够稳定分泌抗IgG抗体。 最后,对这四株单克隆抗体从效价、Ig亚类、特异性以及反应交叉性这些免疫特性方面进行鉴定,通过间接ELISA试验测定,C44、C45、C67、C68四株单克隆杂交瘤细胞株细胞培养上清和小鼠腹水抗体滴度分别为1:400、1:1600、1:3200、1:400和1:640000、1:320000、1:640000、1:80000;小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗即用试剂盒来测定得出四株单克隆抗体的重链均为IgG1型;运用Western Blot方法分析四株单克隆抗体的特异性,表明:C44株、C45株单抗是抗鸡IgG轻链,C67株、C68株单抗与鸡血清中IgG重链发生特异性结合,为抗鸡IgG重链的单抗;以间接ELISA测定四株单克隆抗体与猪、兔和鸭等动物血清的交叉反应性,结果显示单克隆抗体C44、C45、C67、C68仅特异识别鸡IgG,未见与其他动物血清发生交叉反应,并进行Western blot验证,表明C44株、C45株单抗与鸡血清中IgG的轻链发生特异性反应,与鸭、兔、猪血清均没有发生特异性反应,C67株、C68株单抗均抗鸡血清中IgG重链,与鸭、兔、猪血清均不发生特异性结合。……   
[关键词]:鸡IgG;单克隆抗体;IgG_1;特异性;鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2010年