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中国林蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPI2的基因克隆和原核表达

张曙光

   两栖类皮肤是具有巨大开发潜力的生物资源宝库。在过去几十年里,大量激素调节肽和抗菌肽已经被从两栖类的皮肤中分离出来。同时,几种具有蛋白酶抑制活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂也被从两栖类皮肤中分离出来。这些蛋白酶抑制剂已成为研究与蛋白质代谢相关的生物学及医药开发的强有力的工具,引起了医药界的广泛兴趣。 本论文首先根据本实验室已构建的中国林蛙皮肤cDNA文库和EST数据库,获得高表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂的部分cDNA序列(包括完整的poly(A)尾),按照此序列设计并合成引物,以购自辽宁省抚顺市新宾县的中国林蛙为试验材料,提取总RNA,以此为模板,进行了RT-PCR和5′-RACE,从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出丝氨酸蛋白酶抑制剂的cDNA序列全长,并命名RCSPI2,该序列已被收录在GenBank核苷酸序列数据库中,其登录号为GQ303267。序列分析结果表明,中国林蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPI2的cDNA序列全长为876bp,5′-UTR 55bp,3′-UTR 221bp,阅读框由603bp核苷酸组成(包括终止密码子),编码200个氨基酸。属于Kunitz型抑制剂,分子内形成5对二硫键。 将编码成熟肽CDS的目的基因序列亚克隆至pMD19-T Simple克隆载体中测序,结果显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。将经Nco I/Xho I双酶切后的目的基因序列插入原核表达载体pET32 a (+)中,构建重组表达质粒pET-32a-RCSPI2。经过IPTG诱导后,表达相对分子质量36 kDa的重组目的蛋白,与预期大小相符。 采用Ni~(2+)-NTA柱对目的蛋白进行纯化,获得了纯度高达98%的单一目的蛋白条带,分步透析法对目的蛋白进行复性后,用BAPNA法对重组蛋白进行了活性测定,结果显示中国林蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPI2蛋白对胰蛋白酶有较高的抑制作用,且抑制活力曲线成剂量依赖关系。将该重组蛋白免疫新西兰兔,制取兔抗RCSPI2血清抗体,采用ELISA方法对血清抗体的效价进行检测,结果显示通过免疫获得效价很高的兔抗RCSPI2血清抗体。用其作为一抗,采用Western blot方法在中国林蛙皮肤蛋白粗提物中检测到了天然存在的丝氨酸蛋白酶抑制剂,结果也显示了重组丝氨酸蛋白酶抑制剂RCSPI2条带,证明了所制得抗体存在很好的抗原特异性。……   
[关键词]:中国林蛙;丝氨酸蛋白酶抑制剂;基因克隆;原核表达;抑制活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:辽宁师范大学2010年