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致病性弧菌PCR-DHPLC检测及霍乱弧菌快速分型方法的建立

闫平平

   弧菌是对人类危害较大的一类细菌,它普遍存在于动物性食品当中。已经被人类证明的对人类有致病性的弧菌有霍乱孤菌(V.cholerae)、创伤弧菌(V.vulnificus)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),溶藻弧菌(V.alginolyticus)、拟态弧菌(V.mimicus)、梅氏弧菌(V.metschnikovii)等。其中创伤弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、只是偶尔对人类有致病性,而梅氏弧菌很少感染人类,仅有少数分离株从人类的尿液、血液中被分离。这些弧菌都不允许在进出口食品中检出。目前,国内关于致病性弧菌的检测方法主要是生化鉴定法,此方法虽然经典,但操作复杂,检测耗费很长时间,不宜做大批量样本的检测;而且一些样品中由于分离株生化反应不典型,在实际工作中,其检测鉴别存在一定困难,不适宜作为快速检测弧菌的方法。因此不能适应国际进出口贸易的现实需要。因此,本研究目的在于能针对食品中的致病性弧菌建立一种既能快速、准确、高效的检测方法,同时还可以对霍乱弧菌进行快速分型的检测方法,来减少工作量同时又能减少检测成本,来满足进出口食品检验的需要。 以霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌和梅氏弧菌为研究对象,采用试剂盒法提取6种致病性弧菌的标准菌株的基因组DNA,用分光光度计检测提取效果。根据6种弧菌的特异基因序列,设计并合成特异性引物,进行6种弧菌的特异性、敏感度和实际样品的PCR-DHPLC检测。同时依据霍乱弧菌毒素相关基因:胶原酶基因(vcc基因),此基因是霍乱弧菌共有基因;毒力基因(ctxA基因和tcpA基因),这两个基因是O1群和O139群共有基因; O139群特有的毒力基因(LPSgt基因),分别设计合成了四对特异性引物,并对其PCR退火温度和反应体系进行优化来确定最佳的反应条件,进行霍乱弧菌多重PCR-DHPLC快速分型检测。 用6种弧菌的特异性引物和霍乱弧菌相关毒素的特异性引物,经各反应体系和引物退火温度的优化后,建立了6种弧菌的PCR-DHPLC快速检测方法和霍乱弧菌O1群、O139群,非O1群/非O139群的多重PCR-DHPLC快速分型方法。该6种PCR-DHPLC方法的检测敏感度均低于60cfu/mL。 本研究所建立的致病性弧菌的PCR-DHPLC检测及霍乱弧菌快速分型的方法,与传统微生物检测方法和PCR-凝胶电泳法相比,具有快速、准确、高效的优点,在致病性弧菌的检测与霍乱弧菌快速血清分型上具有广泛的应用前景。通过本项目的研究,建立了快速检测食品中致病性弧菌的新方法,并建立了霍乱弧菌的快速分型的新方法,无需繁琐的PCR产物的电泳过程,减少了假阳性的出现,从而节约检测成本,提高检测准确率。……   
[关键词]:变性高效液相色谱;多重聚合酶链式反应;致病性弧菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:辽宁师范大学2010年