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大蒜原生质体融合与培养技术研究

杨茹

   试验于2008-2010年在山东农业大学科技创新园和农业部园艺作物重点开放实验室进行。研究探讨了大蒜鳞茎愈伤组织诱导的影响因素,利用获得的胚性愈伤组织建立了悬浮细胞系,在此基础上研究了原生质体分离、纯化的影响因素,并初步开展了原生质体培养和融合研究。主要研究结果如下: 1研究表明2,4-D在大蒜愈伤组织诱导及继代培养中起关键作用。MS+2,4-D2mg/L+6-BA1mg/L利于大蒜愈伤组织的产生,MS+NAA1mg/L +6-BA0.1mg/L是适宜于愈伤组织增殖和芽分化的最佳培养基。无激素的培养基利于生根;继代2次的愈伤组织的芽分化能力最强。高浓度的生长素有利于大蒜愈伤组织的诱导,但并不利于其分化。 2影响大蒜组织培养的因素:(1)外植体类型:分别以大蒜鳞芽基部、中部、顶部为外植体诱导愈伤组织。基部和中部诱导胚性愈伤组织的最佳培养基MS+2,4-D2 mg/L+6-BA0.5mg/L。MS+2,4-D1.5 mg/L为鳞芽顶部愈伤组织诱导的最佳培养基,诱导率为78.3%。(2)大蒜品种:苏联蒜,苍山蒜和金蒜3号三种基因型中以苍山蒜的出愈率最高,为78.12%,明显高于苏联蒜、金蒜3号。(3)培养基类型:三种类型培养基中以MS培养基的出愈率(82.35%)最高,与B5培养基(68.09%)和1/2MS(62.50%)差异显著。 3以胚性愈伤组织为材料,建立了胚性悬浮细胞系。胚性愈伤组织转入液体培养基时,不同基因型大蒜品种建立稳定的悬浮细胞系所需时间相差不大。细胞个数基本成S型变化。悬浮培养阶段细胞鲜、干重的测定结果表明,培养前期细胞生长速度快,并于第16d达到峰值。 4从悬浮细胞系、胚性愈伤组织、组培叶片分离得到原生质体。继代5d的大蒜悬浮细胞系是原生质体分离的最佳材料,其次是愈伤组织,而从组培苗叶片分离的原生质体产量和活力最低。以悬浮细胞系为分离材料的酶液组成为:2.0%Cellulase Onozuka R-10(纤维素酶)+0.2%Pectolgase Y-23(果胶酶)+0.55 mol/L甘露醇+5mM MES +10mM Cacl_2(pH5.8)。分离大蒜悬浮细胞系原生质体宜采用低速(90rpm)恒温(25±1)℃摇床振荡酶解,时间为5h。纯化时,1000r/min转速下离心5min,能收集到大量有活力的原生质体。适当提高离心力的短时间离心有利于原生质体纯化过程中产量和活力的保持。 5原生质体培养研究发现:采用液体浅层培养的培养效果最好,培养基成分为:1/2MS+1mg/L2.4-D+0.5mg/L6-BA+0.1%水解酪蛋白+1%葡萄糖+0.55mol/L甘露醇,适宜的培养密度为1×10~5个/mL,在此培养条件下的细胞分裂频率达7.4%,细胞团形成频率为0.57%。培养4~5d后,观察到了原生质体第一次分裂。 6由苍山蒜和苏联蒜胚性悬浮细胞制备的原生质体在PEG诱导下进行非对称融合,融合前对苍山蒜原生质体经强度为380uW/cm~2照射30s。目前观察到了苏联蒜和苍山蒜的初步融合情况。……   
[关键词]:大蒜;原生质体;游离;纯化;融合
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2010年