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鸡奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性的研究

朱明华

   鸡奇异变形杆菌病(Proteus mirabilis disease)是近年来国内新发现的一种急性热性细菌性传染病。本病的特征是呼吸困难、咳嗽、体温升高、腹泻。病鸡主要表现为菌血症、败血症,一侧性或两侧性瘫痪或水样腹泻,各种日龄的鸡群都可感染本病,但以7周龄以下的雏鸡最易感。种鸡感染本病后可通过种蛋传给后代,从而造成雏鸡的大批死亡。此病十分容易造成爆发性流行疾病,对养殖业是一种潜在的威胁。孙秋艳等曾采用自制奇异变形杆菌诊断抗原,对来自于河南、安徽、山东、广西等省(自治区)的血清进行流行病学调查,结果表明奇异变形杆菌抗体阳性率普遍较高。 目前,奇异变形杆菌的检测多采用传统的分离鉴定方法。随着分子生物学检测技术的发展和广泛应用,有国外学者对奇异变形杆菌的PCR检测方法做过相关的研究。国内2008年首次有相关报道,但到目前为止,国内关于鸡奇异变形杆菌的PCR及16srRNA等分子方面的检测还未见报道。近年来实验证明,细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(OMP)具有良好的免疫原性,不仅可刺激体液免疫,而且也可刺激细胞免疫作用。因此本试验通过对分离菌QY进行常规等综合鉴定,确定分离的QY为奇异变形杆菌,又进一步对其16SrRNA基因序列进行测定及分析,建立了系统进化树。提取了鸡奇异变形杆QY的OMP,对其免疫原性进行试验;同时用提取的OMP制备了兔抗鸡奇异变形杆菌OMP高免血清,建立了标记抗体检测方法,为快速检测鸡奇异变形杆菌病原或抗体奠定了基础。 本研究主要包括以下内容: 一、鸡奇异变形杆菌分离鉴定及16SrRNA基因序列测定、系统进化分析从山东泰安一鸡场发病雏鸡分离到一株致病菌QY,通过细菌形态学等常规鉴定符合奇异变形杆菌特性。用奇异变形杆菌诊断抗原血清学诊断结果呈阳性,人工感染证明该菌株是造成该场雏鸡大批发病死亡的致病菌。药敏试验结果显示对头孢类、恩诺沙星等高度敏感,而对青霉素和复合磺胺等不敏感。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到QY的16S rRNA基因序列,长约1453bp(GenBank登录号为GU477712)。将该序列与GenBank中序列进行BLAST比对,发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达98%以上。运用DNAStar软件与其中10株奇异变形杆菌分离株构建系统进化树,结果表明QY株与10个代表菌株的同源性均在98.9%-99.9%之间,其中与AB272366同源性最高为99.9%。从分子水平证明该菌是奇异变形杆菌并分析了其遗传进化规律,为鸡奇异变形杆菌的鉴定及其疾病的诊断与治疗提供了参考。 二、鸡奇异变形杆菌外膜蛋白提取及免疫原性的检测 采用改良的方法提取了鸡奇异变形杆菌QY的OMP,通过测定其含量为5.741mg/mL,采用凝胶层析柱分离纯化方法获得分子量为43.0KD的QY有效保护抗原成分(OMP43.0),制备油乳剂QY全菌和OMP抗原、OMP43.0抗原,分别免疫1日龄雏鸡两组。其中一组分别测相应抗体水平并分析抗体动态变化;另一组在免疫14d后,用100 LD50的QY攻毒,统计保护率。结果免疫后7d时,抗体水平开始逐渐上升,42d时,抗体水平分别达到最高,然后逐渐下降,70d时仍保持较高的抗体水平。主动免疫时,OMP和OMP43.0免疫组均得到较高的保护,高于QY全菌免疫组。OMP、OMP43.0和全菌抗原均具有良好的免疫原性和免疫保护作用,为奇异变形杆菌OMP亚单位疫苗的研制奠定了良好的理论基础。 三、鸡奇异变形杆菌OMP高免血清的制备及标记抗体检测方法的建立 将提取的鸡奇异变形杆菌OMP免疫健康新西兰家兔,每周免疫1次,共计免疫4次,获得了兔抗鸡奇异变形杆菌OMP高免血清,建立了检测鸡奇异变形杆菌的间接IFA和ELISA的方法,并对其工作条件进行了优化和筛选,试验结果表明IFA兔高免血清稀释度为1:160,FITC标记羊抗兔IgG稀释度为1:40,感作时间为45min,鸡奇异变形杆菌特异性黄绿色荧光最清晰,非特异性荧光最弱。间接ELISA抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10ug/mL、1:800,酶标二抗工作浓度为1:5000,最佳包被条件为4℃、24h包被;最佳封闭条件为37℃、1h;经临床检测证明该两种方法均具有简便、快速、特异性强的特点,为鸡奇异变形杆菌病的流行病学、血清学调查和临床快速诊断奠定了基础。……   
[关键词]:鸡奇异变形杆菌;16SrRNA;系统进化;外膜蛋白;间接免疫荧光;间接ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2010年