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猪附红细胞体MSG1基因全基因合成、克隆、表达及免疫原性分析

陈甜甜

   附红细胞体在伯杰氏手册中被划分为立克次氏体,但目前国际上根据其16sRNA序列,普遍认为应属于支原体。猪附红细胞体(Mycoplasma suis, M.suis)是一种寄生于猪红细胞上的微生物,能够引起猪的溶血性贫血、黄疸等为主要特征的血液感染性疾病。近几年猪附红细胞体病在全国范围内大面积爆发和流行,对我国的养猪业造成极大的经济损失。为更好的控制该病的发生,我们必须从该病的病原上对其进行详细的研究。目前M.suis 16sRNA基因组片段序列已经可以在GenBank中查到,同时我们还可以从Pubmed中查到关于M.suis的另外三段基因序列的研究报道——1.8kb DNA序列、MSG1粘附蛋白、HSPA1。其中的1.8kb DNA序列对是否属于M.suis的基因尚存在争议性。Hoelzle等通过鸟枪法对M.suis基因组文库进行测序,发现了MSG1蛋白,该蛋白与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)具有高度同源性,并且该蛋白是具有粘附猪红细胞功能的M.suis膜蛋白,不同的分离株中MSG1的序列高度保守,因此研究MSG1蛋白的功能在M.suis的病原学研究上具有重要的作用。 由于M.suis没有最佳的培养方式,很大程度上限制了我们对M.suis的研究。而且M.suis编码的基因采用的是第4套密码子,与大肠杆菌表达系统有冲突,具体来说就是M.suis编码的TGA为色氨酸,但TGA在大肠杆菌表达系统中编码的却为终止密码子。因此,在本次试验中,我们根据GenBank中已发表的猪附红细胞体AM407404序列1011个碱基,将密码子TGA改为TGG,并利用Graphical Codon Usage Analyser,将难以表达的大肠杆菌稀有密码子更换为易于表达的密码子。采用人工设计的28条引物,在最两端的引物上分别设计HindⅢ和NdeⅠ酶切位点,利用引物相互重叠覆盖整个MSG1基因序列,从而得到整个MSG1基因序列。先将MSG1基因连接到PMD18-T simple载体上,测序发现在169和897位发生基因缺失,又设计了OE-PCR的引物,将缺失的基因填补上,将测序正确的MSG1基因亚克隆至原核表达载体pET28c,构建pET28c_msg1表达载体,并转入E.coli BL21中,IPTG对重组基因进行诱导表达。结果表明MSG1可以在原核表达系统中高效表达,用Western blot方法分析鉴定,表达产物具有很好的抗原性(免疫原性)。应用电洗脱的方法获得纯化的目的蛋白。纯化后的重组蛋白接种昆明小白鼠后,用重组蛋白作为抗原包被酶标板,以检测接种昆明小白鼠血清抗体的产生。结果表明MSG1基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,并能够刺激小鼠产生较好的抗体。 综上所述,本研究首次利用全基因合成的方法克隆并成功表达了M.suis MSG1基因,同时分析了MSG1基因的二级结构,疏水性;成功利用间接ELISA方法检测MSG1基因诱导机体产生的抗体,为该基因更深一步的研究、以及以后建立检测M.suis感染的快速诊断试剂盒建立了基础。……   
[关键词]:猪附红细胞体;全基因合成;克隆表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2010年