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根霉ZM-10脂肪酶酶学性质和化学修饰

于忠良

   脂肪酶在酿酒工业中的应用具有十分重要的意义,大曲中的根霉(Rhizopus)是白酒发酵过程中酒体香气成分形成的主要微生物之一。浓香型白酒的风格及酒质的优劣,主要取决于酒体中己酸乙酯含量的高低以及与其它酯类物质的比例是否协调。根霉脂肪酶在酿酒生产中得以应用,但其酶学特性和催化机理未研究阐明,存在酶活较低、生香效果不稳定、增香针对性不强、应用技术条件不明确、使用范围不广等实际问题,在酿酒工业也远未得到充分应用。因此,深入研究和阐明根霉脂肪酶的酶学性质和作用机制对其在食品工业中的应用具有较大的理论和实践意义。本论文以明确根霉ZM-10脂肪酶的酶学性质和活性中心的氨基酸种类为目标,研究了根霉ZM-10脂肪酶分离纯化条件、基本酶学性质、表现酶活性所必需的氨基酸种类,主要结果和结论如下: 1.根霉ZM-10脂肪酶的分离纯化:根霉ZM-10脂肪酶经过硫酸铵盐析、 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Sephardex G-100凝胶过滤层析得脂肪酶,纯化倍数15.3倍,酶活回收率22.2%。根霉ZM-10脂肪酶分离纯化条件为:最佳硫酸铵盐析饱和度70%;DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析最佳条件:上样量5mL、流速3mL/min、每管收集3mL、洗脱体积10倍柱体积、洗脱最佳盐浓度0.4mol/L;Sephardex G-100凝胶过滤层析最佳条件:上样量3mL、流速:自然流速、每管收集1.8mL、洗脱体积:2倍柱体积。经SDS-PAGE凝胶电泳检测得该脂肪酶的分子量约为44kDa。 2.根霉ZM-10脂肪酶的基本酶学性质:对纯化后根霉ZM-10脂肪酶基 本酶学性质研究表明:该脂肪酶的最适反应温度35℃,最适pH为8.0。该酶在20℃下1h时仍保持90%以上的活力,在pH 7.5、8.0具有较高的稳定性。Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)及EDTA对其活性影响较小,Zn~(2+)具有显著的抑制作用。醇类有机溶剂对该脂肪酶的活性有一定的抑制作用,其在极性较小的烷烃类有机溶剂中稳定性良好。 3.根霉ZM-10脂肪酶活性中心的化学修饰:采用NBS、EDC、DEPC、 CH-T、PMSF、DTNB等6种化学修饰剂对根霉ZM-10脂肪酶进行化学修饰、底物保护实验,研究了其分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。实验结果表明:酸性氨基酸(天冬氨酸∕谷氨酸)残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、色氨酸残基为根霉ZM-10脂肪酶活性的必需基团。酸性氨基酸(天冬氨酸∕谷氨酸)残基、组氨酸残基和丝氨酸残基位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位,而色氨酸残基在保持脂肪酶活性中起到重要作用,但其不位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位;通过EDC、DEPC的修饰动力学实验表明根霉ZM-10脂肪酶分子活性中心至少包括一个天冬氨酸(或谷氨酸)残基和一个组氨酸残基。……   
[关键词]:根霉;脂肪酶;分离纯化;酶学性质;化学修饰
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2010年