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苹果α-法尼烯合成酶基因转化番茄研究

于军伟

   α-法尼烯是一种存在于生物体中的倍半萜类物质,已知与植物的抗冷性、昆虫的诱导及冷藏苹果和梨果实重大生理病害-虎皮病的发生有关,是苹果果实中重要的香气成分之一。α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成的关键酶,催化FPP转变为α-法尼烯。 本实验根据Genbank中注册的α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,利用RT-PCR的方法扩增青香蕉苹果α-法尼烯合成酶基因的全长,构建表达载体,优化番茄(中蔬6号)的再生和遗传转化体系,利用农杆菌介导法转化番茄,初步获得转基因植株,并研究了生理特性。 主要结果如下: 1、构建了pBI-AFS正义表达载体,并转化番茄,得到转AFS基因的番茄。 2、以番茄子叶为材料,优化了番茄的再生及遗传转化体系,最适宜番茄子叶再生的培养基为MS+ZT2.0mg/L+ IAA0.5mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,生根培养基为MS+IAA0.5 mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,确定在再生过程中Kan选择压为50mg/L;抑菌过程中头孢霉素100mg/L为宜。 3、通过克隆青香蕉苹果的α-法尼烯合成酶基因(AFS)片段,构建pEASY E1-AFS-原核表达载体,转化大肠杆菌,制备抗体,进行了Western杂交分析,显示该基因在番茄中成功表达。 4、高温处理后转AFS基因番茄比野生型番茄具有较高的耐热性,高温胁迫条件下转基因番茄维持较高的光合能力。 5、通过克隆到α-法尼烯合成酶基因(AFS)全长构建了pBI121-AFS-GFP真核表达载体,原生质体中瞬时表达AFS-GFP融合蛋白,发现该酶定位于叶绿体。 6、GC-MS分析显示,转基因植株叶片中单萜和倍半萜含量明显增加,但没有发现α-法尼烯的释放。……   
[关键词]:α-法尼烯合成酶;再生;载体构建;遗传转化;番茄
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2010年