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苹果多胺和脯氨酸合成代谢相关基因的功能鉴定

王庆莲

  多胺不仅调节植物的生长发育,还参与逆境响应,而脯氨酸则是一种重要的渗透保护物质。多胺和脯氨酸的生物合成代谢由一系列酶催化完成,如多胺生物合成途径中的精氨酸脱羧酶(ADC)和精胺合成酶(SPMS),脯氨酸代谢中的重要酶?1-吡咯琳-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)等。为研究多胺和脯氨酸合成代谢的分子机理,本研究从‘Gala’苹果中克隆了MdADC、MdACL5、MdSPMS和MdP5CDH基因,其中MdADC编码ADC,MdACL5和MdSPMS均编码SPMS,MdP5CDH编码P5CDH,通过基因表达分析和转基因功能鉴定等方法,鉴定了这些基因的生物学功能。主要研究结果如下: 1.克隆了MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的cDNA全长,构建植物表达载体pBI121-MdADC、pBI121-MdSPMS和pBI121-MdACL5,采用农杆菌介导法,将它们分别导入烟草Nc89,获得了各基因的转基因植株。 2.半定量RT-PCR分析和高效液相色谱(HPLC)测定表明MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的过量表达均导致转基因烟草内源多胺含量增加,转基因烟草表现出植株矮化、节间缩短和叶面积增大等表型。 3.非生物胁迫抗性分析发现,MdADC、MdSPMS和MdACL5转基因烟草均对PEG、低温和盐等胁迫表现高抗。在三种胁迫下,与非转基因对照相比,各转基因株系均表现出更高的多胺含量、脯氨酸含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT等)活性、根系活力以及更低的MDA含量和相对电导率。同时发现,与MdACL5相比,MdSPMS转基因烟草的相关表型及抗性更明显。 4.从苹果中克隆分离出了MdP5CDH基因的cDNA全长;半定量RT-PCR分析表明,该基因在苹果各组织器官中组成型表达,开放花中表达最高;同时发现该基因的表达受低温诱导。 5.构建了MdP5CDH基因标签蛋白大小不同的原核表达载体pET-30a-MdP5CDH和pGEX-MdP5CDH,经IPTG诱导分别得到65.14 kDa和88.44 kDa特异蛋白产物,确定该基因编码蛋白大小为61.74 kD。 6.构建了MdP5CDH的正义表达载体pJIT166-MdP5CDH和反义抑制载体pBI121-RevMdP5CDH,并利用农杆菌介导法将它们分别导入‘王林’愈伤组织。半定量RT-PCR分析表明,转正义基因的愈伤组织中MdP5CDH过量表达,而转反义基因的愈伤组织中MdP5CDH表达受抑制。 7. MdP5CDH过量表达导致愈伤组织中脯氨酸含量降低,而抑制表达则使脯氨酸含量升高;各细胞系的生长曲线表明,MdP5CDH过量表达和抑制表达均影响了愈伤组织的生长。……   
[关键词]:苹果;多胺;MdADC;MdSPMS;MdACL5;脯氨酸;MdP5CDH;逆境胁迫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东农业大学2009年