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恩诺沙星化学发光酶免疫分析方法研究

张静

   恩诺沙星(Enrofloxacin, ENR)是一种氟喹诺酮类药物,广泛应用于兽医的疾病治疗。但近年来恩诺沙星应用时所产生的不良反应和耐药性报道越来越多,其在动物性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。目前常用的兽药残留检测方法有高效液相色谱法(HPLC),气相色谱法(GC),薄层色谱法(TLC)等,这些方法存在样品前处理繁琐,仪器昂贵等问题因而不易推广。因此研究出一种简便快速且灵敏的测定ENR残留的方法,对于动物性食品兽药残留的检测具有实际意义。本实验建立了两种不同发光体系的ENR化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIA),并进行了实际样品的检测。 1.碱性磷酸酶-金刚烷(ALP-AMPPD)(?)体系CLEIA测定ENR方法的建立。包被缓冲液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(CB, pH9.6),包被抗体浓度为2μg/mL,包被方法为热包被,37℃,150分钟,采用碳化二亚胺的偶联方法,透析时间为6天,用0.01mol/L pH 7.2的PBS缓冲液稀释偶联物,最佳化学发光反应时间为8分钟,发光剂用CB缓冲液1:4(V发光剂:VCB)稀释后每孔加入25μL。在最佳检测条件下进行的竞争CLEIA检测,得到的ENR线性回归方程为:,其中Y为发光值的对数,x为相应ENR浓度的对数,相关系数为0.9977,线性范围为350~1000 pg/mL,检测限为239.9 pg/mL,批内RSD为7.33%~9.08%(n=5),批间RSD为9.52%~13.28%(n=5),标准回收率为96.3%~103.3%。 2.辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢(HRP-Luminol-H2O2)体系CLEIA测定ENR方法的建立。包被缓冲液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(CB, pH9.6),包被抗体浓度为3μg/mL,包被方法为热包被,37℃,150分钟,采用碳化二亚胺的偶联方法,透析时间为5天,用0.01 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液稀释偶联物,封闭温度为25℃,封闭时间为2小时,封闭量为150μL/孔,最佳免疫反应时间为1小时,免疫反应温度为37℃,最佳化学发光反应时间为3分钟,发光剂用CB缓冲液1:2(V发光剂:VCB)稀释后每孔加入25μL。在最佳检测条件下进行的竞争CLEIA险测,得到的ENR线性回归方程为:其中Y为发光值的对数,x为相应ENR浓度的对数,相关系数为0.9974,线性范围在350~1000pg/mL之间,检测限为30.2pg/mL,批内RSD为7.75%~9.42%(n=5),批间RSD为9.19%~13.05%(n=5),标准回收率为99.9%~100.0%。 3.实际样品检测中CLEIA法与HPLC法、ELISA法分析结果的比较,三种方法的检测限依次为30.2pg/mL,6.0ng/mL,3.6ng/mL,测定牛奶样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为96.7%,88.6%,94.3%,相对标准偏差依次为8.27%,3.72%,10.28%;测定鸡蛋样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为97.0%,90.8%,94.4%,相对标准偏差依次为7.98%,3.13%,9.40%;测定蜂蜜样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为97.9%,89.2%,93.7%,相对标准偏差依次为8.46%,3.61%,10.07%;测定血浆样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为98.2%,86.6%,92.5%,相对标准偏差依次为8.99%,4.09%,8.53%。……   
[关键词]:恩诺沙星;化学发光酶免疫分析;实际样品应用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年