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志贺菌诱导耐药相关基因序列克隆与测序

朱雪冰

   志贺菌是细菌性痢疾的病原体,全世界每年大约有1.65亿人感染志贺.菌,以发展中国家居多,患者多为五岁以下儿童。在我国,志贺菌引起的细菌性痢疾发病率仍居感染性腹泻的前三位,是传染病防治工作的重点。近年来,志贺菌的耐药现象日益严峻,不仅耐药广泛,且耐多药株逐渐增多,这为细菌性痢疾的防治带来很大挑战。 志贺菌耐药性的来源主要有两种方式:通过基因转移的水平方式和通过药物自身诱导的垂直方式。基因水平转移是指由质粒、转座子、整合子和基因岛等可移动遗传因子介导的在细菌种内和种间获得和传播耐药性的方式。药物自身诱导获得耐药性是指细菌在抗生素压力下,通过某些遗传学机制的变化获得耐药性。为了解在抗生素诱导下,细菌耐药性的产生与基因组自身改变的关系,本课题组曾通过抗生素诱导的方式获得了志贺菌敏感株的耐多药菌株,并成功构建了敏感株和耐多药株基因组的抑制性消减杂交文库,初步筛选到与耐多药株相关的差异基因片段。 在以前研究的基础上,对耐药相关基因序列进行分析,推测耐药性是如何发生的和发生的可能部位,为探索志贺菌诱导耐多药的分子机制提供线索,为耐药性检测提供科学依据和技术手段。 1菌株的复苏与鉴定:对-80℃保存菌株以划线法复苏并接种生化鉴定管进行血清学鉴定,以保证菌株的可靠性。 2提取DNA:分别提取YD(诱导耐多药株)和Z23(敏感株)的遗传物质DNA和含有差异基因片段质粒pMD18-T-X(Y16A11、Y16B3、Y19C3、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8)的DNA,作为PCR反应的模板。 3聚合酶链式反应(PCR) (1)以上述质粒DNA为扩增模板扩增差异基因片段; (2)以Z23和YD基因组DNA为扩增模板扩增差异基因片段; (3)扩增产物检测:1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物长度; 4相关基因的克隆和鉴定:琼脂糖凝胶电泳分离回收PCR产物,将回收的相关基因片段与pMD19-T载体连接,转化DH5α感受态大肠杆菌,氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选法筛选阳性重组子。并且应用菌落PCR和质粒单、双酶切来鉴定阳性重组子。 5基因序列测定与同源性检索:将阳性克隆交由北京三博远志生物技术有限责任公司完成测序;在序列相似性搜索工具Blast上检索核苷酸序列,并分析其同源性。 6斑点杂交:随机引物法标记将回收纯化后差异基因片段Y16A11-Y、Y16A11-Z、Y16B3、Y19C3-Y、Y19C3-Z、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8制成探针。分别以相应的阳性克隆的质粒DNA为阳性对照,与YD和Z23的质粒和基因组DNA进行斑点杂交。 1质粒DNA PCR扩增:以pMD18-T-X(Y16A11、Y16B3、Y19C3、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8)质粒DNA为模板,选择差异基因片段引物,分别扩增出449bp(Y16A11)、481bp(Y16B3)、317bp(Y19C3)、1075bp(Y19C1)、298bp (Y19C4)、413bp (Y16C4)、298bp (Y16B8)长度的片段,与预期结果相符。 2 PCR扩增结果:YD菌株(诱导株)分别扩增到长度为310bp(Y16A11-Y)、320 bp(Y16B3)、124bp(Y19C3-Y)、422bp(Y19C1)、193bp(Y19C4)、227bp(Y16C4)、225bp(Y16B8)基因DNA片段,敏感株仅扩增到2种产物,即554bp(Y16A11-Z)和388bp(Y19C3-Z)基因片段。 3扩增片段的克隆:将上述获得的YD和Z23扩增片段与pMD19-T载体连接,转化DH5α感受态大肠杆菌,获得Y16A11-Y、Y16A11-Z、Y16B3、Y19C3-Y、Y19C3-Z、Y19C1、Y19C4、Y16C4、Y16B8等相应的阳性克隆菌株。对阳性克隆菌株进行PCR鉴定,分别扩增到310bp、554bp、320bp、124bp、388bp、422bp、193bp、227bp、225bp的基因片段,与预期结果一致。质粒的单酶切和双酶切结果也均与预期一致。 4核苷酸序列测定和同源性检索:Y16A11-Y(310bp):为质粒pBS512_5的编码基因序列的一部分;Y16A11-Z(554bp):与脂肪酸代谢调节因子编码序列的同源性为96%-97%;Y16A11-Y和Y16A11-Z基因片段的核苷酸序列同源性极低;Y16B3(320bp):前113 bp基因序列与保守的假定蛋白同源性为99%,后218bp基因序列与IS200C相关转座酶基因序列同源性为99%;Y19C3-Y(124bp):没有搜索到相似的同源序列,可能为未知序列;Y19C3-Z(388bp):该基因序列编码假定的多药外排转运蛋白;Y19C3-Y与Y19C3-Z的序列同源性低;Y19C1(422bp):该核苷酸序列与多药排出系统组成部分有关;Y19C4(193bp):122-193这一段序列是质粒pBS512-5的编码基因序列上的一部分。Y16C4(227bp):为位点特异性Ⅰ型脱氧核糖核酸酶的编码基因;Y16B8(225bp):前67bp为质粒pBS512-5的编码基因序列; 5斑点杂交结果:探针Y16B8,Y16A11-Y,Y19C3-Y,Y16C4,Y19C4与YD质粒和基因组DNA杂交信号均增强,而且基因组杂交信号和质粒杂交信号增强程度差别不大;探针Y16B3只与YD基因组杂交信号增强;探针Y16A11-Z,Y19C3-Z与YD基因组、质粒DNA和Z23基因组DNA均有较强的杂交信号,而与Z23质粒DNA杂交信号较弱;探针Y19C1的杂交信号均比较弱。 1志贺菌在抗生素诱导下产生的耐多药株与敏感菌株比较,具有基因组差异。 2志贺菌诱导耐多药株的获得可能是基因突变和遗传重组共同作用的结果。 3垂直诱导获得的耐药基因可能位于染色体上,也可位于质粒或其他可转移遗传元件(转座子、整合子/基因盒系统及噬菌体)上。……   
[关键词]:志贺菌;耐多药;斑点杂交
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年