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化学发光酶免疫分析法测定磺胺对甲氧嘧啶

闫娜利

   本课题是将化学发光技术与免疫学技术相结合,即化学发光酶免疫分析法来定量测定抗生素药磺胺对甲氧嘧啶在食品中的残留。采用竞争法,即将待测样品中的磺胺对甲氧嘧啶与一定量的标记有辣根过氧化物酶的磺胺对甲氧嘧啶(或标记有碱性磷酸酶的磺胺对甲氧嘧啶)竞争性地与固相磺胺对甲氧嘧啶抗体进行结合,通过分离未结合的标记抗原,测定标记抗原与抗体复合物化学发光强度,经相应的数学函数计算出待测抗原的含量。根据这一基本原理,分别利用鲁米诺体系和金刚烷类体系作为化学发光底物,快速地测定食品中的磺胺对甲氧嘧啶残留量。 本课题主要是从以下几个方面进行研究: 1辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢发光体系的研究 1.1首先是选择一种理想的方法将酶标记在药物小分子上,经筛选得出用重氮化偶联法能较好地进行辣根过氧化物酶的标记,并用以下三种方法来鉴定标记复合物:首先是偶联物的颜色变为紫红色;其次,从紫外图谱可以看出偶联物在233nm处有一特征吸收峰且有位移;最后,从偶联物红外光谱图中可以看出:在3500~4000cm-1区域,2250~2500 cm-1区域及1250~1750 cm-1区域有辣根过氧化物酶中氨基酸的特征峰,在900-1160 cm-1区域又有磺胺对甲氧嘧啶的特征峰。 1.2其次优化实验条件,最佳条件为:抗体包被浓度为2.5μg/ml,酶标记物工作液稀释度为1:4,每孔加待测样品或标准品50μl和酶标记物50μl,在37℃下反应1h,洗涤后每孔加发光底物100μl,避光反应1.5min后在发光检测仪下检测发光计数。 该方法学检测限为3.2pg/ml,批内相对标准偏差小于13%,批间相对标准偏差小于18%。标准曲线回归方程为y=-0.0063x+6.6846(x是标准样品浓度的对数,y是发光强度的对数),线性范围为10~2000pg/ml,相关系数为0.9952。 2碱性磷酸酶-金刚烷类发光体系的研究 2.1首先同样是选择一种理想的方法将酶标记在药物小分子上,经筛选得出用重氮化偶联法能较好标记碱性磷酸酶,并用三种方法来鉴定标记复合物:首先是偶联物的颜色变为紫红色;其次,从紫外图谱中可知偶联物在238nm处有一特征吸收峰且有位移;最后,从偶联物红外光谱图中可以看出:在3500-4000cm-1区域,2250~2500 cm-1区域及1250-1750 cm-1区域有碱性磷酸酶中氨基酸的特征峰,在800-1200 cm-1区域又有磺胺对甲氧嘧啶的特征峰。 2.2其次优化实验条件,最佳条件为:抗体包被浓度为5.0μg/ml,酶标记物工作液稀释度为1:10,每孔加待测样品或标准品50μl和酶标记物50μl,在37℃下反应1h,洗涤后每孔加发光底物100μl,避光反应25min后在发光检测仪下检测发光计数。 该方法学检测限为28.0pg/ml,批内相对标准偏差小于15%,批间相对标准偏差小于18%。标准曲线回归方程为y=-0.0215x+5.1726(x是标准样品浓度的对数,y是发光强度的对数),线性范围为50~10000pg/ml,相关系数为0.9961。 3对实际样品进行检测 3.1用建立起来的辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢发光体系对牛奶、鸡蛋、蜂蜜和血浆中磺胺对甲氧嘧啶的含量进行检测,回收率分别为:91.0%~104.0%、84.0%-92.0%、90.0%~113.0%、110.0%-119.0%,符合要求。 3.2将化学发光酶免疫分析与酶联免疫吸附法、高效液相色谱法进行比较,得知前者的检测限比后两种方法的都要低,且操作也更简便。虽然高效液相色谱法稳定性好,但前处理很麻烦,且耗资大,也费时,由此更显示出化学发光酶.免疫分析法快速、简便、高灵敏度等的特点。……   
[关键词]:化学发光酶免疫分析;辣根过氧化物酶;碱性磷酸酶;磺胺对甲氧嘧啶单克隆抗体;磺胺对甲氧嘧啶
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年