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PDX-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

辛宁

   背景和目的: 目前,糖尿病的治疗方法不能使所有糖尿病患者血糖理想控制,胰岛细胞移植治疗糖尿病引起国内外学者的关注,但异体胰岛细胞移植由于胰岛细胞来源不足和免疫排斥反应等问题限制了其临床应用。 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一类非造血干细胞,可以分化为内胚层的细胞如胰岛样细胞和脂肪细胞等。MSCs取材方便、易于分离培养,体外扩增能力强,遗传性能稳定,易于转染和稳定表达外源基因,避免免疫排斥反应,且不存在人胚胎干细胞的伦理、道德问题,是细胞和组织工程理想的种子细胞,逐渐成为人们寻找治疗糖尿病所需的胰岛样细胞的新来源。 胰腺-十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1, PDX-1)在人类又被称为胰岛素启动因子-1(insulin promoter factor-1, IPF-1),是胰腺发育早期表达的一个转录因子,不仅对于肠内胚层背侧及腹侧胰腺萌芽的生长分化起着重要的作用,还参与了胰岛细胞分化发育成熟的过程。 本研究拟构建含有PDX-1基因的真核表达载体,通过脂质体转染技术,将所构建的重组表达载体转入大鼠BMSCs中,筛选稳定表达株细胞,为后续研究即诱导其向胰岛样细胞分化及移植治疗糖尿病做好前期准备。 方法: 1.PDX-1基因cDNA片段的克隆及真核表达载体的构建 1.1根据GenBank上登录的PDX-1的cDNA全长序列设计引物。以提取的总RNA为模板进行RT-PCR,将扩增出的PCR产物连接到pMD18-T载体上,然后进行测序并与GenBank上的PDX-1基因序列进行比对分析。 1.2重组载体的构建与鉴定 测序鉴定正确的重组质粒分别用引物对应的酶切位点进行双酶切,回收相应的片段。同样对真核表达载体pcDNA3.1(+)及绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1进行相应的酶切,回收载体片段。用T4DNA连接酶分别连接上述回收的片段,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109细胞,涂板,过夜培养,挑取克隆,提取质粒,双酶切鉴定。 2.大鼠BMSCs的体外培养及筛选含PDX-1的稳定转化株 2.1利用全骨髓贴壁培养法分离、原代培养BMSCs 2.2BMSCs表面标记鉴定及生长曲线测定 2.3细胞转染 2.4荧光显微镜观察pEGFP-PDX-1基因定位 2.5利用遗传霉素(Geneticin,G418)筛选转染重组载体pcDNA3.1(+)-PDX-1的稳定转化株细胞 2.6RT-PCR检测PDX-1基因的表达 结果: 1.提取的总RNA完整性好,无降解。PDX-1基因的克隆,扩增出特异的DNA条带,约883bp,与预期结果相符。经HindⅢ和BamHI双酶切鉴定及测序分析,重组载体含有大小、方向和读码框均正确的插入片段。 2.分离获得原代大鼠BMSCs,细胞免疫荧光示CD29、CD44阳性表达,CD34阴性表达,符合BMSCs特征。pEGFP-PDX-1基因定位:荧光显微镜观察显示转染空质粒pEGFP-C1的细胞,绿色荧光分布于整个细胞,而转染重组质粒pEGFP-PDX-1的细胞,细胞中央荧光更浓,提示细胞转染定位于细胞核。 3.稳定转染株的筛选与鉴定 RT-PCR结果显示未处理正常组BMSCs和转染pcDNA3.1(+)空载体的阴性对照组无PDX-1目的片段。pcDNA3.1(+)-PDX-1转染株中扩增出PDX-1基因的目的片段,证明PDX-1基因成功转入BMSCs并获得pcDNA3.1(+)-PDX-1的稳定转化株。 结论: 1.本研究成功克隆小鼠PDX-1基因片段,并构建了重组真核表达载体 2.通过融合绿色荧光蛋白的真核表达载体的转染,证明转入的PDX-1基因定位于大鼠BMSCs胞核,筛选得到pcDNA3.1(+)-PDX-1的稳定转化株……   
[关键词]:骨髓;间充质干细胞;胰腺-十二指肠同源盒-1基因;克隆;转染
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年